การผลิตและแยกบริสุทธิ์เอนไซม ์cholesterol oxidase, cholesterol esterase และ peroxidase เพื่อพัฒนาชุดน้ำยาสำหรับตรวจวัดระดับโคเลสเตอรอลในกระแสเลือด

บทคัดย่อ

โครงการวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อเตรียมและแยกบริสุทธิเอนไซม์ฮันได้แก่ Cholesterd ovidose. cholesterol esterose และ peroxdose เพื่อพัฒนาซุดน้ำยาสำหรับตรวจวัดระดับโตเลสเตอรอลในกระแส เสือต ผลการศึกษาผู้วิจัยได้ทำการทตสอบแบคที่เรีย Streptomyces lavendioe สายพันธ์ในประเทศไทยซึ่ง ได้มาจาก BCC (Bictec Culture Collection) แล้วพบรำาแบคทีเรียชนิตนี้สามารถสร้างเฮนไซม์ Cholesterd oxidase และ choiesterdl esterase และหลั่งออกมาใน culture meda ได้ พบว่า cuitre condition ที่ เหมาะสมคือเลี้ยงที่ 25C โดยมี 1.5%6 potato starch เป็น carton source เป็นเวลา 72 ชั่วโมง พบว่า detergent ไม่มีผลเพิ่มหรือลดการหลั่งของ CH0 แต่อย่างใค เมื่อทดสอบคุณสักษณะของ CHO ที่สร้างจาก แบคที่เรีย Sreptoryces avendube พบว่าเอนไซม์ชนิดนี้ทำงานได้ตี่ที่ช่วง DH ระหว่าง 5-7 และช่ง คุณหภูมิระหว่าง 30-50c การศึกษาถึงบริมาณการสร้างและหลั่งเอนไซม์ CHE ตามรรมชาติของแบคทีเรีย Streptomivces avendube พบว่าหลังจากการปรับปรุง Cuture condion แล้ว ปรึมาณการผลิตและหลั่ง CHE ก็ยังตงต่ำอยู่ ผู้วิจัยจึงตัตสินใจที่จะผลิตเอนไซม์ CHE จากแบคที่เรีย Pseudomonc onas ceroginosa Migula ซึ่งเป็นสายพันธ์ที่ ได้มาจาก ATCC (Americn Type Culture Collection) จากการปรับปรุงพบว่าแบตทีเรีย Pseudomonas aeroginosa Migua ที่ได้มาสามารถผสิตอนไซม์ chalesterd estrcrse ในปริมาณที่สูงกว่าของแบตทีเรีย Streptamyces lavenduioe โดยที่อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการ cuture คือ 37 C โดยที่ไม่จำเป็นต้องมีการ เติมน้ำมันลงใน cuiture medla แต่อย่างไรก็ตามพบว่าการเติม dotergent (0.5% Tween n-20) ลงใน culture media ช่วง 3 ชั่วโมงสุดท้ายก่อน harvesting จะช่วยเพิ่มปริมาณของเอนไซม์ที่หลั่งออกมาใน cuture media ได้อีกเท่าตัว พบว่าเอนไซม์ชนิดนี้ทำงานได้ที่ที่ช่วง pH ระหว่าง 8-7.5 และช่วงอุณหภูมิระหว่าง 40-55C ในส่วนของการเตรียมเอนไซม์ Peroxidse ผู้วิจัยได้ทำการสกัดเอนไซม์จากพืช 3 ชนิด ยันได้แก่ หัว ไซเท้า (Chinese rudisl) และ หัวผักกาห เตแตง (re๔ roตtรh) และบรอคเคอรี่พบว่าเอนไซมัเหล่านี้สามารถ ทำงานได้ดีที่ช่วง PH และอุณหภูมิที่กว้าง และมีตวามคงตัวที่นาน ผลการนำเอนไซม์ที่เตรียมได้เป็น ส่วนประกอบชุดตรวจในการวิเคราะห์ระตับโคเลสเตอรอลในซีรัมเปรียบเทียบกับเอนไซม์ Horse Radish Peroxidase (HRP) ที่ซื้อมาจากบริษัท Sigma Alrich (cot. P8140) wบว่าเฮนไซม์ Perovidose s จากพืชทั้งสาม ชนิดให้ผลการทดสอบปริมาณ Cholesterol ใน serum ตัวอย่างจำนวน 30 ราย ไปในทางเดียวกันโดยมีคำ R ที่สูง (อยู่ในช่วงระหว่าง 0.975-0.901) โดยเอนไซม์ Peroxdose จากพืชหัวไซเท้าจะให้ค่า R ที่สูงที่สุดคือ 0.991 และให้สีที่เข้มที่สุด ผลการการวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบว่เอนไซม์ Peroxidose ที่เตรียมขึ้นเองสามารถ โช้แทน HRP ที่ซื้อมาจากบริษัท Sgma Adich ได้หรือไมโดยดูจาก Bland-Atman pict พบว่าค่าตวามแปรปรวนของข้อมูลส่วนใหญ่อยู่ในช่วง ?1.96 SD อว่ายอมรับไ โดยพบว่าคำเฉสียของความแปรปรวน ของเอนไซม์ peroxidงse จากหัวไซเท้ามีค่าต่ำสุด ดังนั้นพืชชนิดนี้จึงน่าจะเป็นแหร่งของ งเอนไซม์ที่มีความ เหมาะสมมากที่สุดที่จะนำไปเป็นส่วนประกอบของ chclesterol assay kit เมื่อผสิตเอนไซม์ให้ครบทั้ง 3 ตัวแล้ว ผู้วิจัยจึงได้เตรียมน้ำยาที่จะใช้ในการตรวจวัดปริมาณ cholesterol ในกระแสเสือดซึ่งผลการทำ cptimization พบว่าปริมาณที่เหมาะสมของเอนไซม์แต่ละชนิดใน น้ำยาตรวจวัด cholesterol คืe cholesterol ester 0.2 unitsiml, dholesterol oxidase 0.1 units/ml แล: peroxidase 0.5 unitsm! ผลการทดสอบความคงตัวของน้ำยาพบว่มีความคงตัวที่อุณหภูมิห้องได้นานกว่า 9 ชั่วโมง แต่ถ้าเก็บที่ 40C จะอยู่ใด้ 7 วัน และถ้าเก็บแช่แข็ง (-20C หรือ -70*C) จะเก็บไห้นานกว่า 3 เตือน ซึ่งผลการทตสอบเบื้องตัน พบว่าชุดน้ำยาที่ได้มี lineaty ในช่วงความเข้มธันธEง cholesterol ตั้งแต่ 70-850 mgd. ซึ่งครอบคลุมช่วงค่าที่จะพบได้ในผู้ป่วยซึ่งมักไม่เกิน 350 mg/dL การทดสอบ บผลการรบกวน จาก interfering substonce อย่าง bilirubin (icteric serum) และ hemogiotin (hemolysed serum) ซึ่งเป็นสาร รบกวนที่พบได้บ่อยในชีรัมตัวอย่างพบว่าไม่มีผลรบกวนจนถึงที่ระตับ +2 โตยสรุปขณะนี้ผู้วิจัยได้ทราบวิธีการเตรียมและคุณลักษณะของเอนไซม์ซึ่งเป็นส่วนประกอบของ Cholesterol assay kt ทั้งหมตแล้วได้แก่ cholosterol oxidose, cholesterol esterose และ Peroxidase และได้ แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ทั้ง 3 ตัวสามารถใช้ผลิตน้ำยาสำหรับตรวจสอบปริมาณ cholesterol ในกระแสเลือด ได้ประสบความสำเร็จ

คำสำคัญ