การสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคในปลานิลและการค้นหาและทดสอบสารต้านหรือยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อดังกล่าวจากสารสกัดธรรมชาติเพื่อนำมาทดแทนการใช้ยาปฏิชีวนะ ปีที่ 2

บทคัดย่อ

การก่อโรคของแบคทีเรียในคนและสัตว์ส่วนใหญ่มักจะมีความสัมพันธ์หรือขึ้นกับความสามารถในการเกาะและการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคเหล่านั้นในหรือบนตัวสัตว์หรือในสิ่งแวดล้อมที่สัตว์อาศัยอยู่ วิธีการควบคุมโรคที่เกิดจากเชื้อแบคทีเรียวิธีหนึ่งคือการยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของแบคทีเรียโดยใช้สารที่ไม่ฆ่าหรือยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียก่อโรคชนิดนั้นแต่ไปรบกวนการสื่อสารของแบคทีเรียทำให้แบคทีเรียไม่สามารถสร้างหรือลดการสร้างไบโอฟิล์ม เอนไซม์หรือสารพิษที่เป็นอันตรายต่อสัตว์ ในปีที่สองของโครงการนี้คณะผู้วิจัยได้พัฒนาวิธีการเพาะเลี้ยงไบโอฟิล์มของเชื้อก่อโรคในปลานิลเพิ่มเติมอีกสอง isolates ได้แก่เชื้อ Francisella noatunensis และ Streptococcus agalactiae serotype 1a (ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่ท่านผู้ทรงคุณวุฒิแนะนำให้ทำเพิ่มเติมจากเดิมที่ทดสอบเพียง group B serotype 3 เพียง serotype เดียว) จากปีก่อนหน้าที่ได้ทำสำเร็จไปแล้ว 6 ชนิด 7 isolates รวมทั้งสิ้น 9 isolates ซึ่งประกอบด้วยสองเชื้อข้างต้นและเชื้อ Aeromonas jandaei, A. veronii, A. hydrophila, S. agalactiae, และ Flavobacterium columnare โดยเลี้ยงบนพื้นผิวของถาดหลุมพลาสติกชนิด polystyrene ทั้งที่เคลือบและไม่เคลือบด้วย gelatin ที่แยกจากหนังปลานิลหรือ chitosan ที่แยกจากเปลือกกุ้ง สำหรับเชื้อ Fran. noatunensis ได้ทดลองเลี้ยงด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ต่างกันรวม 7 สูตร จากนั้นได้นำวิธีที่พัฒนาได้ไปทดสอบและคัดกรองหาสารที่มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มแต่ไม่ยับยั้งการเจริญเติบโตในอาหารเหลวของเชื้อดังกล่าว โดยในปีนี้ได้คัดกรองหาสารที่ยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อแบคทีเรียก่อโรคเพิ่มอีก 6 isolates ได้แก่ เชื้อ A. hydrophila, S. agalactiae serotype 1a, Fla. columnare จำนวน 3 isolates และ Fran. noatunensis นอกจากนี้แล้วยังได้ทำการทดสอบเพื่อหาวิธีทำให้ปลานิลติดเชื้อ (infection models) ที่เหมาะสมสำหรับเชื้อ Fla. columnare, A. veronii, A. jandaei และ A. hydrophila ก่อนจะนำ infection models ที่ได้ไปทดสอบผลของการให้สารสกัดที่มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อทั้งสี่ดังกล่าว โดยการนำสารหรือเชื้อที่ยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อก่อโรคไปผสมอาหารให้ปลานิลกินก่อนและหลังการทำให้ปลานิลติดเชื้อ ผลการทดสอบที่ได้คือสารสกัดเหล่านี้สามารถปกป้องหรือทำให้ปลานิลรอดตายได้มากขึ้นเช่นเดียวกับการให้สารยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อ S. agalactiae ที่ทดสอบในปีแรกของโครงการ ยกเว้นของ A. hydrophila ที่ยังไม่สามารถสรุปได้เพราะปลานิลที่ทดลองมีอัตราการตายที่ต่ำมากผลที่ได้จึงไม่ต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) จากการตรวจดูการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อ Fla. columnare isolate 15 เมื่อได้รับน้ำเลี้ยงเซลล์ของเชื้อ Leuconostoc pseudomesenteroides SC1 ซึ่งเป็นแลคติกแอซิดแบคทีเรียชนิดหนึ่ง พบว่า SC1 ยับยั้งการแสดงออกของยีนหลายยีนที่เกี่ยวข้องกับการนำเหล็กสู่ตัวเซลล์ (Iron acquisition) และ Quorum sensing ซึ่งก็คล้ายกับ S. agalactiae ที่ได้รับสารสกัดจากถั่วเหลืองหมัก (ที่หมักด้วย Bacillus subtilis BSN1) ที่การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงของเชื้อหลายยีนรวมถึงยีน luxS ซึ่งเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้าง autoinducer 2 ใน quorum sensing pathway มีการแสดงออกที่ลดลง โดยสรุปแล้วจากผลการศึกษาที่ได้ในโครงการนี้เราพบว่าเราสามารถลดอัตราการตายของปลานิลจากการติดเชื้อแบคทีเรียส่วนใหญ่ได้ด้วยสาร/เชื้อจุลินทรีย์โปรไบโอติกที่ไม่ฆ่าเชื้อแบคทีเรียก่อโรคหรือไม่ใช่ยาปฏิชีวนะ แต่เป็นสาร/เชื้อที่มีฤทธิ์ยับยั้ง Quorum sensing ที่ควบคุมการสร้างไบโอฟิล์มและยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงของเชื้อก่อโรค แหล่งที่มาของสารเหล่านี้มาจากทั้งพืชและจุลินทรีย์ในกลุ่มที่ใช้ผลิตอาหารคนเช่นถั่วหมักและใช้เป็นโปรไบโอติกที่สามารถผลิตได้ง่ายและราคาไม่แพงดังนั้นจึงมีความเป็นไปได้สูงที่จะนำไปประยุกต์ใช้จริงในฟาร์มเกษตรกร