การใช้โปรติเนสที่หลั่งออกนอกเซลล์และตรึงอยู่กับเซลล์จากแบคทีเรีย ชอบเค็ม/ทนเค็มในกระบวนการหมักน้ำปลา

บทคัดย่อ

แบคทีเรีย Virgibacillus sp. SK37 ซึ่งคัดแยกได้จากตัวอย่างเดือนแรกของการหมักน้ำปลามีความสามารถในการย่อยสลายปลากะตักและเคซีน (Casein) ที่ความเข้มข้นโซเดียมคลอไรด์ร้อยละ 10 และ 25 จึงอาจเป็นสายพันธุ์ที่มีศักยภาพเป็นกล้าเชื้อสำหรับกระบวนการหมักน้ำปลา ซึ่งแนวทางดังกล่าวจะนำไปสู่การพัฒนากระบวนการลดระยะเวลาการหมัก ดังนั้นวัตถุประสงค์ของโครงการวิจัยนี้เพื่อศึกษาแนวทางการผลิตโปรติเนสที่หลั่งออกมานอกเซลล์ (Extracellular proteinase) ของ Virgibacillus sp. SK37 โดยใช้ผลิตผลพลอยได้จากอุตสาหกรรมอาหารเป็นส่วนประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อและสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์โปรติเนส และศึกษาคุณลักษณะทางชีวเคมีของการประยุกต์ใช้เอนไซม์ที่ตรึงอยู่กับเซลล์ (Cell-bound proteinase) ในการหมักน้ำปลา ผลิตผลพลอยได้จากอุตสาหกรรมอาหารทั้ง 5 ชนิด ได้แก่ กากถั่วเหลือง รำข้าว โปรตีนถั่วเขียว กากยีสต์ และกากน้ำปลา พบว่ากากยีสต์เป็นแหล่งไนโตรเจนที่เหมาะสมที่สุดในการสร้าง โปรติเนสที่หลั่งออกนอกเซลล์จาก Virgibacillus sp. SK37 โดยการใช้กากยีสต์ 1% ที่ความเข้มข้นของเกลือโซเดียมคลอไรด์ 2.5% ที่ pH 7.5 อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส โดยให้ค่ากิจกรรมสูงกว่าการใช้ยีสต์สกัดทางการค้า (Commercial yeast extract) 1.7 เท่า โปรติเนสที่ตรึงอยู่ที่เซลล์ที่ผลิตจาก Virgibacillus sp. SK37 ถูกสกัดโดยใช้สารละลายบัพเฟอร์ทริส-มาลิเอต (Tris-maleate) เข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ที่ผสมสารละลายกรดเอธิลีนไดเอมีนเททราอะซิติก (Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) เข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ไซโมแกรม (Zymogram) ของโปรติเนสที่ตรึงอยู่ที่เซลล์ที่ผลิตจากแบคทีเรีย Virgibacillus sp. SK37 โดยใช้ เพป-ไทด์สังเคราะห์เป็นสารตั้งต้นแสดงโมเลกุลขนาด 19 20 22 32 34 และ 44 กิโลดาลตัน โปรติเนสนี้แสดงลักษณะของเอนไซม์สับทิลิซิน (Subtilisin) โดยแสดงกิจกรรมสูงสุดที่ 50 องศาเซลเซียส พีเอช 8 และ 11 กิจกรรมของโปรติเนสที่สกัดได้เพิ่มขึ้น 4 เท่า ที่ความเข้มข้นของแคลเซียมคลอไรด์มากกว่าหรือเท่ากับ 100 มิลลิโมลาร์ นอกจากนี้แคลเซียมคลอไรด์ยังเพิ่มความคงทนต่ออุณหภูมิของโปรติเนสด้วย เอนไซม์แสดงกิจกรรมการย่อยสลายกล้ามเนื้อปลา โปรตีนถั่วเหลืองสกัด และเคซีนทั้งในสภาวะที่ไม่มีและมีเกลือโซเดียมคลอไรด์ที่ 10 และ 25% การเติมแคลเซียมคลอไรด์ในระดับ 0.2% ร่วมกับเซลล์ของ Virgibacillus sp. SK37 ในกระบวนการหมักน้ำปลา พบว่ามีการย่อยสลายโปรตีนในระหว่างกระบวนการหมักเพิ่มขึ้น (P<0.05) เมื่อวิเคราะห์จากปริมาณกลุ่มแอลฟาอะมิโน บ่งชี้ได้ว่า โปรติเนสที่ตรึงอยู่กับเซลล์ของ Virgibacillus sp. SK37 อาจเป็นเอนไซม์ที่มีบทบาทต่อการย่อยสลายโปรตีนปลาในระหว่างกระบวนการหมักน้ำปลา การศึกษาผลของโปรติเนสที่ตรึงอยู่ที่เซลล์จาก Virgibacillus sp. SK37 ร่วมกับการลดปริมาณเกลือ หรือ การลดปริมาณเกลือร่วมกับการเพิ่มพีเอชในระหว่างกระบวนการหมักน้ำปลาโดยเติมเซลล์Virgibacillus sp. SK37 จำนวน 6 Log CFU/กรัม พบว่าการลดปริมาณเกลือโซเดียมคลอไรด์ในกระบวนการหมักลงจาก 30% เหลือ 15% แต่เพียงอย่างเดียว และการลดปริมาณเกลือลงเหลือ 15% พร้อมกับปรับพีเอชเริ่มต้นให้เป็น 6.8 ไม่มีผลต่อการขยายระยะเวลาการอยู่รอดของกล้าเชื้อ Virgibacillus sp. SK37 เนื่องจากตรวจพบเชื้อในระยะเวลา 14 วัน ของกระบวนการหมัก จากการสังเกตรูปพรรณสัณฐานของโคโลนีบนอาหาร JCM 168 ที่เติมเกลือโซเดียมคลอไรด์ 10% แต่การลดเกลือและเพิ่มพีเอชส่งผลให้เกิดแบคทีเรียหลากหลายชนิดมากกว่าตัวอย่างที่เติมเกลือ 30% หลังจากหมักเป็นเวลา 180 วัน ปริมาณกลุ่มแอลฟาอะมิโนของทุกตัวอย่างมีค่า 1046-1162 มิลลิโมลาร์ โดยการลดปริมาณเกลือแต่เพียงอย่างเดียวและการลดปริมาณเกลือร่วมกับการเพิ่มพีเอชเริ่มต้นของกระบวนการหมักมีผลเพิ่มปริมาณกลุ่มแอลฟาอะมิโนเมื่อเทียบกับการหมักด้วยเกลือ 30% (P<0.05) ปริมาณไนโตรเจนทั้งหมดของทุกตัวอย่างมีค่า 2.2-2.7% การลดเกลือแต่เพียงอย่างเดียวไม่มีผลต่อปริมาณ ไบโอจินิกเอมีนของผลิตภัณฑ์แต่การลดเกลือร่วมกับการเพิ่มพีเอชของกระบวนการหมักเป็น 6.8 ส่งผลให้ปริมาณฮีสตามีนและคาดาเวอรีนเพิ่มขึ้น (P<0.05) การหมักน้ำปลาโดยการลดเกลือร่วมกับปรับพีเอชเริ่มต้นเป็น 6.8 ส่งผลให้เกิดสารระเหยในปริมาณที่สูงโดยเฉพาะไดเมธิลไดซัลไฟด์ (Dimethyl disulfide) ซึ่งเป็นสาเหตุของกลิ่นอุจจาระ (Fecal note) ในขณะที่การหมักที่ลดเกลือลง15% แต่เพียงอย่างเดียว ส่งผลให้ได้น้ำปลาที่มีชนิดและปริมาณสารระเหยใกล้เคียงกับการหมักแบบดั้งเดิมที่มีสัดส่วนของเกลือโซเดียมคลอไรด์ 30% (P<0.05)

คำสำคัญ