การใช้สารสกัดลำไยล้นตลาดความเข้มข้นสูง สำหรับการผลิตเอทานอลด้วยถังหมักต่อเนื่องแบบอนุกรม และเซลล์รวมเพื่อผลิตฟีนิลแอซีติลคาร์บินอล ด้วยระบบไบโอทรานส์ฟอร์เมชั่นพร้อมหน่วยคัดแยกเซลล์และหมุนเวียนใช้ตัวทำละลายอินทรีย์

บทคัดย่อ

การวิจัยในครั้งนี้ได้ทำการคัดเลือกเชื้อยีสต์สายพันธุ์ Saccharomyces cerevisiae TISTR 5606 และ Candida tropicalis TISTR 5306 ที่มีความสามารถในการผลิตเอทานอลและการผลิตฟีนิลแอซี ติลคาร์บินอลในระดับ 100 มิลลิลิตร ในสารสกัด่ลำไยสดล้นตลาดเกรด AA, A, B และ C อีกทั้งยังได้ใช้สาร สกัดลำไยสดคละเกรดความเข้มข้นต่ำจนถึงความเข้มข้นที่ใช้ในระดับอุตสาหกรรม (100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 กรัมต่อลิตร) จากนั้นจึงนำเชื้อยีสต์ที่ผ่านการคัดเลือกไปผลิตเอทานอลในถังหมัก ระดับ 10 ลิตร แบบกะ แบบต่อเนื่อง และแบบต่อเนื่องอนุกรม ในสารสกัดลำไยสดคละเกรดล้นตลาดความ เข้มข้น 120 กรัมต่อลิตร และในสารสกัดลำไยสดคละเกรดล้นตลาดความเข้มข้นสูงในการหัวข้อการวิจัยก่อน หน้าโดยทั้ง 2 การวิจัย ได้วิเคราะห์หาค่าพีเอช ค่าของแข็งที่ละลายได้ในน้ำ ความเข้มข้นน้ำตาล ความเข้มข้น เอทานอล ความเข้มข้นโปรตีน ความเข้มข้นมวลชีวภาพแห้ง ความเข้มข้นฟีนิลแอซีติลคาร์บินอล นอกจากนี้ยัง ได้ผลิตฟีนิลแอซีติลคาร์บินอลด้วยมวลเซลล์รวมและเอนไซม์ที่ผ่านการทำบริสุทธิ์บางส่วนในถังทำปฏิกิริยาที่มี ระบบการควบคุมอุณหภูมิและพีเอช จากผลการเพาะเลี้ยงเชื้อยีสต์ S. cerevisiae TISTR 5606 และ C. tropicalis TISTR 5306 ในสาร สกัดลำไยสดเข้มข้นตั้งแต่ 100 – 300 กรัมต่อลิตร พบว่า S. cerevisiae TISTR 5606 และ C. tropicalis TISTR 5306 จะสามารถทนทานต่อความเข้มข้นน้ำตาลได้สูงสุดที่ระดับความเข้มข้นลำไยสด 250 และ 150 กรัมต่อลิตร ตามลำดับ และสามารถผลิตเอทานอลได้ระดับความเข้มข้นสูงสุด 78.06 ? 0.32 และ 21.65 ? 0.27 กรัมต่อลิตร ที่เวลา 48 ชั่วโมงตามลำดับ โดยมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p ? 0.05) ทั้งนี้ S. cerevisiae TISTR 5606 จะสามารถใช้น้ำตาลซูโครส กลูโคส ฟรุกโตส และน้ำตาลทั้งหมดของ สารสกัดลำไยสดเข้มข้น 250 กรัมต่อลิตร ได้ 0.26 ? 0.13, 115.50 ? 1.75, 92.97 ? 0.86, และ 206.78 ? 2.52 กรัมต่อลิตร ที่เวลา 48 ชั่วโมง หรือคิดเป็นร้อยละ 82.70 ของการใช้น้ำตาลทั้งหมด ส่วน C. tropicalis TISTR 5306 ที่ระดับความเข้มข้น 150 กรัมต่อลิตร จะใช้ความเข้มข้นน้ำตาลซูโครส กลูโคส ฟรุกโตส และ น้ำตาลทั้งหมด ได้ที่ 4.73 ? 1.50, 47.02 ? 1.19, 88.49 ? 5.81, และ 140.25 ? 5.54 กรัมต่อลิตร ที่เวลา 48 ชั่วโมง อนึ่งเมื่อคำนวณหาค่าผลได้การผลิตเอทานอล (YP/S) ที่เวลา 48 ชั่วโมง พบค่าผลได้ 0.38 ? 0.01 กรัมเอทานอลที่ผลิตได้ต่อกรัมน้ำตาลทั้งหมดที่ใช้ไป สำหรับ S. cerevisiae TISTR 5606 ในสารสกัดลำไยสด เข้มข้น 250 กรัมต่อลิตร และ 0.16 ? 0.01 กรัมต่อกรัม สำหรับ C. tropicalis TISTR 5306 ในสารสกัดลำไย สดเข้มข้น 150 กรัมต่อลิตร โดยมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p ? 0.05) ความสามารถในการใช้ น้ำตาลซูโครสที่ลดลงของยีสต์ทั้งสองชนิดในการศึกษานี้ อาจเกิดจากขั้นตอนการเตรียมสารสกัดน้ำตาลลำไย เข้มข้นที่ส่งผลทำให้เกิดสารเคมีที่มีฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์อินเวอร์เทสในการย่อยสลายน้ำตาล ซูโครส ให้กลายเป็นน้ำตาลกลูโคส และฟรุกโตส และต้องมีการศึกษาอย่างละเอียดต่อไป สำหรับการผลิตมวล ชีวภาพแห้งในสารสกัดลำไยสดเข้มข้น 250 กรัมต่อลิตร ที่เวลา 72 ชั่วโมง พบระดับการผลิตที่ 10.61 ? 0.15 กรัมต่อลิตรในกรณีของ S. cerevisiae TISTR 5606 ซึ่งสูงกว่า C. tropicalis TISTR 5306 (5.91 ? 0.03 กรัมต่อลิตร ในสารสกัดลำไยสดเข้มข้น 150 กรัมต่อลิตร) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p ? 0.05) นอกจากนี้ยัง พบว่าความเข้มข้นโปรตีนที่วิเคราะห์ได้จาก S. cerevisiae TISTR 5606 (1.16 – 1.23 มิลลิกรัมต่อ มิลลิลิตร) นั้นไม่ได้มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p > 0.05) สำหรับสารสกัดลำไยเข้มข้นแต่ละ ระดับที่นำมาทดสอบเพาะเลี้ยง เช่นเดียวกันกับกรณีของ C. tropicalis TISTR 5306 (1.22 – 1.44 มิลลิกรัม ต่อมิลลิลิตร) กระบวนการหมักแบบกะของสารสกัดลำไยสดแบบคละเกรดความเข้มข้น 120 กรัมต่อลิตร ด้วยเชื้อ ยีสต์ S. cerevisiae TISTR 5606 ที่มีระบบการกวน ควบคุมอุณหภูมิ และให้อากาศ พบว่าปริมาณน้ำตาล กลูโคสจะลงลงอย่างรวดเร็วในช่วงเวลาที่ 0 – 12 ชั่วโมง โดยจะมีอัตราการใช้ความเข้มข้นน้ำตาลกลูโคส (dSG/dt) ที่ 1.20? 0.06 กรัมน้ำตาลกลูโคสต่อลิตรต่อชั่วโมง ส่วนน้ำตาลฟรุกโตสจะถูกใช้ที่ 10.94? 0.95 กรัมต่อลิตร (ร้อยละ 43.55) หรือมีอัตราการใช้น้ำตาลฟรุกโตส (dSF/dt) ที่ 0.91 ? 0.08 กรัมน้ำตาลฟรุกโตส ต่อลิตรต่อชั่วโมง ส่วนน้ำตาลซูโครสจะถูกใช้ไปเพียงเล็กน้อยที่ 1.05? 0.11 กรัมต่อลิตร ปริมาณมวลชีวภาพ แห้งจะมีความเข้มข้นที่ 3.97 ? 0.14 กรัมต่อลิตร และมีอัตราการผลิตมวลชีวภาพแห้ง (dX/dt) อยู่ที่ 0.33 ? 0.01 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง ค่าเจริญเติบโตจำเพา (?) และเจริญเติบโตจำเพาะสูงสุด(?max) (0.0907 และ 0.0956 ต่อชั่วโมง ซึ่งกระบวนการหมักแบบกะนี้จะสามารถผลิตเอทานอลได้ที่ 21.15? 0.17 กรัมต่อลิตร หรือมีอัตราการผลิตเอทานอล (qP) ที่ 1.76? 0.01 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง จากนั้นเมื่อกระบวนการหมักแบบ กะผ่านไปถึง 60 ชั่วโมง จึงได้เปลี่ยนกระบวนการหมักเป็นแบบต่อเนื่องด้วยการป้อนอาหารหรือสารสกัดลำไย สดคละเกรดความเข้มข้น 120 กรัมต่อลิตร เข้าสู่ถังหมักที่ระดับ 0.021 ลิตรต่อชั่วโมง นาน 72 ชั่วโมง ซึ่งจะ สามารถผลิตเอทานอลได้เข้มข้นสูงสุดที่ 32.34 กรัมต่อลิตร คิดเป็นอัตราการผลิตเอทานอล (rP) ที่ 5.32 กรัม ต่อลิตรต่อชั่วโมง อัตราการใช้สารตั้งต้น (rS) อยู่ที่ 0.16 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง โดยอัตราการใช้สารตั้งต้นที่มาก สุดจะอยู่ในช่วงเวลา 48 – 72 ชั่วโมง และเป็นช่วงที่มีอัตราการเจริญเติบโตจำเพาะและอัตราการเจริญเติบโต จำเพาะสูงสุดที่ 0.0179 และ 0.0240 ต่อชั่วโมง มีอัตราการเจริญเติบโต (rX) ที่ 0.274 ? 0.008 กรัมต่อลิตร ต่อชั่วโมง ให้มวลชีวภาพแห้งสูงสุดที่ 15.35 ? 0.10 กรัมต่อลิตร เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาได้เพิ่มอัตราการป้อน อาหารเข้าที่ 0.042 ลิตรต่อชั่วโมง นาน 72 ชั่วโมง ซึ่งเมื่อเวลาผ่านไปถึง 120 และ 144 ชั่วโมง อัตราการผลิต เอทานอลจะเพิ่มสูงขึ้นเป็น 5.32 และ 5.36 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง ตามลำดับ ปริมาณความเข้มข้นมวลชีวภาพ แห้งมีความเข้มข้นที่ 15.41 และ 15.24 กรัมต่อลิตร ตามลำดับ จะเห็นได้ว่ามวลเซลล์เริ่มลดลงที่เวลา 144 ชั่วโมง เนื่องจากปริมาณสารตั้งต้นที่เติมเข้าไปปริมาตรสูงขึ้นทำให้เชื้อยีสต์ S. cerevisiae TISTR5606 ไม่จะ สามารถเจริญเติบโตได้ทันและเริ่มเกิดปรากฏการณ์ชะออก (wash out) อีกทั้งความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่ เวลา 120 – 144 ชั่วโมง เริ่มเข้าสู่ค่าคงที่ กระบวนการหมักแบบกะด้วยสกัดลำไยสดคละเกรดความเข้มข้น 250 กรัมต่อลิตร ปริมาณน้ำตาล กลูโคสจะถูกใช้จนหมดที่เวลา 36 ชั่วโมง คิดเป็นอัตราการใช้ปริมาณน้ำตาลกลูโคส (qSG) ที่เวลา 36 ชั่วโมง จะมีอัตราที่ 10.01 ? 0.07 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง ส่วนน้ำตาลฟรุกโตสจะถูกใช้หมดที่เวลา 54 ชั่วโมง หรือ 127.78 ? 1.37 กรัมต่อลิตร หรือ 10.65 ? 0.11 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง โดยปริมาณมวลชีวภาพแห้งจะมี ปริมาณความเข้มข้นสูงสุดที่เวลา 39 ชั่วโมง 16.33? 0.10 กรัมต่อลิตรโดย (ค่าการเจริญเติบโตจำเพาะ และ การเจริญเติบโตจำเพาะสูงสุดจะอยู่ที่เวลา 12 ชั่วโมง จะมีค่าสูงสุด 0.0914 ? 0.002 และ 0.0810 ? 0.001 ต่อขั่วโมง ตามลำดับ) ส่วนปริมาณความเข้มข้นเอทานอลจะสูงสุดที่เวลา 60 ชั่วโมง 65.36 ? 0.30 กรัมต่อ ลิตร โดยปริมาณความเข้มข้นเอทานอลจะเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วที่ช่วงเวลา (36 และ 48 ชั่วโมง 43.19 ? 0.14 และ 63.56 ? 0.87 กรัมต่อลิตร) โดยมีอัตราการผลิตเอทานอลที่ 3.60 ? 0.01 และ 5.30 ? 0.07 กรัมต่อ ลิตรต่อชั่วโมง หลังจากกระบวนการหมักเข้าสู่เวลาที่ 42 ชั่วโมง ได้เริ่มเปลี่ยนเข้าสู่กระบวนการหมักเป็น แบบต่อเนื่องด้วยอัตราการป้อนเข้าที่ 0.005 ลิตรต่อชั่วโมง ซึ่งทำให้ได้ปริมาณเอทานอลที่ได้จะมีความเข้มข้น สูงสุดที่ 48.8 ? 0.2 กรัมต่อลิตร ที่เวลา 78 ชั่วโมง โดยในช่วงเวลาที่ 72 – 90 ชั่วโมง จะมีอัตราการผลิตเอทา นอล (rP) สูงที่สุดถึง 7.65 ? 0.21 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง และมีอัตราการใช้สารตั้งต้น (rS) อยู่ที่ 1.95 ? 0.12 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง และอัตราการสร้างมวลเซลล์ (rX) สูงสุดจะอยู่ที่ 0.224 ? 0.004 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง ในเวลาที่ 72 ชั่วโมง จะมีค่าเจริญเติบโตจำเพาะสูงสุดที่ 0.0168 ? 0.0005 ต่อชั่วโมง จากที่กล่าวมาค่า เจริญเติบโตจำเพาะ และค่าเจริญเติบโตจำเพาะสูงสุดจะมีค่าใกล้เคียงกับช่วงเวลาที่ 0 – 24 และ 24 – 48 ชั่วโมง นอกจากนี้ปริมาณมวลเซลล์ชีวภาพแห้งที่ได้นี้ก็แสดงผลที่สอดคล้องไปในทางเดียวกันในระบบการหมัก แบบต่อเนื่องด้วยสารสกัดลำไยสดคละเกรดความเข้มข้น 120 กรัมต่อลิตร คือ มวลเซลล์จะสร้างเป็นจำนวน มากในช่วงเวลาเริ่มต้น แต่ไม่เกิน 72 ชั่วโมง ส่วนกระบวนการหมักแบบต่อเนื่องอนุกรมที่ใช้น้ำหมักที่ล้นออก จากท่อล้นออก (overflow) จะมีปริมาณเอทานอลจะสามารถผลิตได้ความเข้มข้นสูงสุดที่ 40.9 ? 0.8 กรัมต่อ ลิตร ที่ช่วงเวลา 78 ชั่วโมง ซึ่งที่ช่วงเวลานี้ 72 – 90 ชั่วโมง จะมีอัตราการผลิตเอทานอลอยู่ที่ 6.73 ? 0.11 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง และมีอัตราการใช้สารตั้งต้นอยู่ที่ 0.44 ? 0.01 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง โดยในช่วงเวลานี้ จะมีค่าเจริญเติบโตจำเพาะสูงที่สุดที่ 0.0116 ? 0.004 ต่อชั่วโมง นอกจากนี้ยังมีค่าอัตราการเจริญเติบโตที่ 0.0757 ? 0.008 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง ที่เวลา 0 – 24 ชั่วโมง ปริมาณมวลชีวภาพแห้งจะสามารถผลิตได้ สูงสุดที่ 8.13 ? 0.08 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง ณ ช่วงเวลาที่ 24 - 48 ชั่วโมง อย่างไรก็ตามค่าการเจริญเติบโต จำเพาะและเจริญเติบโตจำเพาะสูงสุดในช่วงเวลา 72 – 90 ชั่วโมง มีค่าใกล้เคียงกับกระบวนการหมัก แบบต่อเนื่องด้วยสารสกัดลำไยสดคละเกรดความเข้มข้น 250 กรัมต่อลิตร การผลิตฟีนิลแอซีติลคาร์บินอลด้วยกระบวนการไบโอทรานส์ฟอร์เมชั่นที่ใช้เซลล์รวมของเชื้อยีสต์ C. tropicalis TISTR 5350 และเอนไซม์ที่ผ่านการทำบริสุทธิ์บางส่วน ที่ได้ทดสอบความเข้มข้นของฟอสเฟต บัพเฟอร์พีเอชเริ่มต้น 7.0 ที่ 20, 250, 500, และ 1,000 มิลลิโมล่าร์ และความเข้มข้นของเบนซาลดีไฮด์และ โซเดียมไพรูเวต (สารตั้งต้น) ที่ 30/40, 50/60, และ 100/120 ในสภาวะที่มีใบกวน อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส และการหมุนเวียนเซลล์ ซึ่งจากผลการวิจัยพบว่าความเข้มข้นฟีนิลแอซีติลคาร์บินอลจะมีปริมาณสูงสุดถึง 95.80 ? 0.10 มิลลิโมล่าร์ ในฟอสเฟตบัพเฟอร์ความเข้มข้น 250 มิลลิโมล่าร์ ด้วยสารตั้งต้นเบนซาลดีไฮด์และ ไพรูเวตความเข้มข้น 100 และ 120 มิลลิโมล่าร์ ตามลำดับ ใช้เวลาทำปฏิกิริยา 150 นาที รองลงมาจะเป็น ฟอสเฟตบัพเฟอร์ความเข้มข้นที่ 1000, 500 และ 20 มิลลิโมล่าร์ ที่ใช้ความเข้มข้นสารตั้งต้นเดียวกันจะ สามารถผลิตความเข้มข้นฟีนิลแอซีติลคาร์บินอลได้ที่ 89.71 ? 0.62, 85.46 ? 0.65 และ 83.66 ? 0.46 มิลลิ โมล่าร์ ตามลำดับ นอกจากนี้เมื่อทำการเปรียบเทียบการนำเอนไซม์ที่ผ่านการทำบริสุทธิ์บางส่วน และการใช้ มวลเซลล์รวมพบว่า การใช้เอนไซม์ที่ผ่านการทำบริสุทธิ์บางส่วนนั้นจะมีประสิทธิภาพในการเกิดปฏิกิริยากับ สารตั้งต้นได้ที่ 0.96 ? 0.01 โมลฟีนิลแอซีติลคาร์บินอลต่อโมลเบนซาลดีไฮด์ และ 0.80 ? 0.01 โมลฟีนิลแอซี ติลคาร์บินอลต่อโมลไพรูเวต ส่วนการใช้มวลเซลล์รวมเอนไซม์จะเกิดปฏิกิริยาได้น้อยกว่าโดยมีค่าที่ 0.31 ? 0.02 โมลฟีนิลแอซีติลคาร์บินอลต่อโมลเบนซาลดีไฮด์ และ 0.26 ? 0.01 โมลฟีนิลแอซีติลคาร์บินอลต่อโมล ไพรูเวต ซึ่งมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ (p ? 0.05)

คำสำคัญ