การโคลนและการแสดงออกของยีนที่กำหนดการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสกลุ่มที่ 9 ที่คัดเลือกมาจากรูเมนของกระบือ
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
กระบือเป็นสัตว์เคี้ยวเอื้องที่สามารถกินหญ้าที่มีคุณภาพต่ำได้ดีเนื่องจากระบบย่อยอาหารในส่วน กระเพาะหมักมีจุลินทรีย์หลากหลายชนิดซึ่งสามารถสร้างแอนไซม์เพื่อช่วยในการย่อยเยื่อใยพืชให้เป็น สารอาหารที่มีคุณค่ต่อตัวสัตว์ โครงการวิจัชนี้มีจุดประสงค์เพื่อจำแนกยืนที่กำหนดการสร้างเอนไซม์เซลลู เลสกลุ่มที่ 9 จากกระเพาะหมักของกระบือปลักอาศัยวิธีการทางเมทาจี โนมิกส์ โดยทำการออกเบบไพรเมอร์ จากบริเวณอนุรักษ์ของยืนที่กำหนดการสร้างเอนไซม์กลุ่มที่ ของแบคทีเรียกลุ่มแกรมบวก ทำการเพิ่ม ปริมาณชิ้นยืนขนาค 1,200 กูเบส ด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส ตัดต่อชิ้นยืนเข้าสู่เวเตอร์ IZS7R/T และ ถ่ายยีนเข้าสู่ชื้อแบคทีเรียเจ้าบ้านสายพันธุ์ Escherichia coli DH5? เมื่อเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนจาก การแปลรหัสกับฐานข้อมูลยืน พบว่ามี 6 โคลนที่มีบริเวณอนุรักษ์ของเอนไซม์เซลลูเลสในกลุ่มไกลโคไซด์ ไฮโดรเลสกลุ่มที่ 9 ได้แก่ ce19-1, ceJ9-2, cel9-3, cel94, cc19-A และ ce19-B เมื่อวิเคราะห์หาลำดับนิวคลี โอ ไทด์ที่สมบูรณ์ด้วยเทคนิค gcnome walking พบว่าโกลน ceI9-B สามารถนพบยืนที่สมบูรณ์มีความยาว 2,100 คู่เบส และแปลรหัสเป็น โปรตีนยาว 699 กรดอะมิโน โปรตีน Cel9-B มีความเหมือนของลำดับ กรดอะมิโนมากที่สุด (53%) กับเอนไซม์เซลลูเลสกลุ่มที่ 9 จากแบคทีเรีย Ruminococcus sp. 18P13 (CBL 17554.1) พบตำแหน่งของ signal peptide ที่กรคอะมิโนตำแหน่งที่ 1-43 มีโคเมนไกลโคไซด์ ไฮโดรเลสกลุ่มที่ 9 อยู่ที่กรดอะมิโนตำแหน่งที่ 49-454 และพบ โคเมน dockerin ype I อยู่ที่กรดอะมิโน ตำแหน่งที่ 617-682 ตามลำคับ ซึ่งจัดว่าเป็นเอนไซม์เซลลูเลสกลุ่มที่ 9 กลาสที่ 1 และมีโครงสร้างเป็น แบบเซลลูโลโซม หลังการสร้างพลาสมิดลูกผสมที่บรรจุส่วนของยืนGH9 เชื่อมต่อเข้าในจีโนมของยีสต์ เจ้าบ้านสายพันธุ์ Kixyveromyces lacis GG799 และคัดเลือกโกลนยีสต์ลูกผสมให้ชื่อว่า PKLAC2- Cel9B/GH9-K3 เมื่อการเลี้ยงขีสต์ลูกผสมและเก็บโปรตีนที่หลั่งออกมาในอาหารเหลว พบว่าโปรตีน รวมในอาหารเหลวมีความเข้มข้น 803.87 มิลลิกรัมต่อลิตร หลังการเลี้ยงเชื่อ 7 วัน และมีขนาดโมเลกุล ของโปรตีน 49.7 กิโลดาลตันเมื่อตรวจสอบด้วยเจล SDS-PAGE เอนไซม์ Ce19B/GH9-K3 ที่ได้สามารถ ย่อยสับสเตรตคาร์บอกซีเมทิลซลลูโลส ะไวเซล กระดายกรอง และไซแลน โดยมีค่าจำเพาะต่อ กิจกรรมเท่ากับ 0.624 ? 0.036, 0.083 ? 0.013, 0.154 ? 0.032 และ 0.178 ? 0.029 หน่วยต่อมิลลิกรัม ของโปรตีนรวม ตามลำคับ ซึ่งแสดงว่าเอนไซม์นี้มีกิจกรรมเอน โดกลูกาเนส เอกโซกลูคาเนส และไซ แลนเนส เอนไซม์ CeI9B/GH9-K3 มีสภาวะที่เหมาะสมของการย่อย 1% CMC ที่ pH 6.0 อุณหภูมิ 60C ในระยะเวลากรบ่มปฏิกิริขา 10 นาที นอกจากนี้เอนไซม์ยังสามารถย่อย CMC ได้ในช่วง pH 3-11 และ อุณหภูมิ 30-80 C โดยยังคงมีค่ากิจกรรมสัมพันธ์มากกว่า 40% ของค่าสูงสุด เอนไซม์ที่ได้จาก โครงการวิจัยนี้สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมที่เกี่ยวข้อง เช่น การย่อยเยื่อกระดาษ การผลิต เอทานอลจากเยื่อใยพืช รวมถึงการผลิตอาหารสัตว์ อย่างไรก็ตามต้องนำไปทดสอบความเหมาะสมใน การใช้งานต่อไป