เอนไซม์ทริปซินจากตับปลาทูน่าพันธุ์ครีบยาว (Thunnus alalunga): การทำบริสุทธิ์ การแยกส่วนและการจำแนกคุณลักษณะ
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
จากการศึกษากิจกรรมของเอนไซม์โปรตีเนสจากตับปลาทูน่าพันธุ์ครีบยาว (Thunnus alalunga) พบว่าเอนไซม์โปรตีเนสมีพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการย่อยสลายเคซีนเท่ากับ 8.5 และ 55 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เอนไซม์มีความคงตัวต่อความร้อนที่อุณหภูมิไม่เกิน 50 องศาเซลเซียส และมีความคงตัวต่อพีเอชในช่วง 7.0-10.0 เป็นเวลา 30-120 นาที กิจกรรมของเอนไซม์ถูกยับยั้งอย่างมีประสิทธิภาพด้วยสารยับยั้งเอนไซม์ทริปซินจากถั่วเหลือง (SBTI) TLCK และ PMSF กิจกรรมของเอนไซม์โปรตีเนสลดลงอย่างต่อเนื่องเมื่อความเข้มข้นของโซเดียมคลอ-ไรด์เพิ่มขึ้น (ร้อยละ 0-30) ในขณะที่กิจกรรมของเอนไซม์โปรตีเนสเพิ่มขึ้นเมื่อความเข้มข้นของแคลเซียมคลอไรด์เพิ่มขึ้น เอนไซม์โปรตีเนสจากตับปลาทูน่าพันธุ์ครีบยาวมีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 21 24 30 และ 34 กิโลดาลตัน เมื่อตรวจสอบด้วยวิธี activity staining จากการศึกษาผลของสารสกัดต่อการเก็บเกี่ยวเอนไซม์โปรตีเนสจากตับปลาทูน่าพันธุ์ครีบยาว พบว่าการสกัดตับปลาทูน่าพันธุ์ครีบยาวด้วยสารละลายโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ที่ระดับความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ พีเอช 7.0 ที่มี Brij 35 ความเข้มข้นร้อยละ 0.2 ให้ประสิทธิภาพในการเก็บเกี่ยวเอนไซม์โปรตีเนสสูงกว่าสารสกัดชนิดอื่น ๆ (P<0.05) จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าเอนไซม์โปรตีเนสตัวหลักที่พบในตับปลา ทูน่าพันธุ์ครีบยาวคือ เอนไซม์โปรตีเนสที่เป็นด่างที่ถูกกระตุ้นด้วยความร้อนซึ่งมีลักษณะคล้ายกับเอนไซม์โปรตีเนสชนิดซีรีนโดยเฉพาะเอนไซม์ทริปซิน จากการศึกษาการเก็บเกี่ยวเอนไซม์โปรตีเนสจากตับปลาทูน่าพันธุ์ครีบยาวโดยใช้ aqueous two-phase system (ATPS) พบว่า ATPS ซึ่งประกอบด้วยพอลิเอทธิลีนไกลคอล (น้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 1000) ที่ระดับความเข้มข้นร้อยละ 25 และโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟต ความเข้มข้นร้อยละ 20 พีเอช 7.0 เป็นสภาวะที่ดีที่สุดในการแยกส่วนเอนไซม์โปรตีเนสไปยังเฟสบน และให้กิจกรรมจำเพาะสูงสุด (20.65 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน) และมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 5.58 เท่า มีผลผลิตเท่ากับร้อยละ 89.99 การเติมโซเดียมคลอไรด์ที่ระดับความเข้มข้นไม่เกินร้อยละ 6 ส่งผลให้ความบริสุทธิ์และผลผลิตของเอนไซม์โปรตีเนสลดลง เอนไซม์โปรตีเนสที่ผ่านการแยกส่วนมีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 21 24 30 และ 34 กิโลดาลตัน เมื่อตรวจสอบด้วยวิธีอิเลคโตรฟอรีซีส จากการศึกษาผลของเอนไซม์โปรตีเนสที่ผ่านการแยกส่วนด้วยวิธี ATPS ต่อการย่อยสลายกล้ามเนื้อปลาวัว (Abalistes stellaris) พบว่าเอนไซม์โปรตีเนสที่ผ่านการแยกส่วนด้วยวิธี ATPS สามารถย่อยสลายกล้ามเนื้อปลาวัวได้ทั้งนี้ขึ้นกับปริมาณเอนไซม์ จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า ATPS เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเก็บเกี่ยวและทำบริสุทธิ์เอนไซม์โปรตีเนสโดยไม่จำเป็นต้องอาศัยหลายขั้นตอนในการทำบริสุทธิ์ นอกจากนี้เอนไซม์โปรตีเนสที่ผ่านการแยกส่วนสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการเตรียมโปรตีนไฮโดรไลเสต เอนไซม์ทริปซินสองไอโซฟอร์ม (เอ และ บี) จากตับปลาทูน่าพันธุ์ครีบยาว (Thunnus alalunga) สามารถทำบริสุทธิ์โดยการใช้ Sephacryl S-200 Sephadex G-50 และ DEAE-cellulose ตามลำดับ โดยเอนไซม์ทริปซิน เอ และ บี มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 80.35 และ 101.23 เท่า และได้ผลผลิตร้อยละ 3.1 และ 19.2 ตามลำดับ เมื่อตรวจสอบด้วยวิธีเจลฟิวเตรชันและ SDS-PAGE เอนไซม์ทริปซิน เอ และ บี มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 21 และ 24 กิโลดาลตัน ตามลำดับ เอนไซม์ ทริปซินทั้งสองปรากฏเป็นแถบโปรตีนเดี่ยวบนเจล native-PAGE เอนไซม์ทริปซิน เอ และ บี มีกิจกรรมสูงสุดที่อุณหภูมิ 60 และ 55 องศาเซลเซียส ตามลำดับ และมีพีเอชที่เหมาะสมที่พีเอช 8.5 เมื่อใช้ N?-p-Tosyl-L-arginine methyl ester hydrochloride (TAME) เป็นสารตั้งต้น เอนไซม์ทั้งสองมีความคงตัวในช่วงอุณหภูมิไม่เกิน 50 องศาเซลเซียส และมีความคงตัวในช่วงพีเอช 7-11 นอกจากนี้ความคงตัวของเอนไซม์ทั้งสองขึ้นกับการมีแคลเซียมไอออน จากการทดสอบผลของสารยับยั้งพบว่า สารยับยั้งเอนไซม์ทริปซินจากถั่วเหลือง และ TLCK แสดงกิจกรรมการยับยั้งเอนไซม์อย่างมีประสิทธิภาพ กิจกรรมของเอนไซม์ทริปซิน เอ และ บี ลดลงอย่างต่อเนื่องเมื่อความเข้มข้นของเกลือเพิ่มขึ้น (ร้อยละ 0-30) ลำดับของกรดอะมิโนปลายสายด้านหมู่อะมิโนจำนวน 20 หน่วยย่อยของเอนไซม์ทริปซินทั้งสองไอโซฟอร์ม มีลำดับของกรดอะมิโนปลายสายด้านหมู่อะมิโนที่มีความคล้ายกันและคล้ายกับเอนไซม์ทริปซินจากสัตว์น้ำอื่น ๆ