การเพิ่มผลผลิตรีคอมบิแนนท์อินซูลิน โดยการเพิ่มจำนวนชุดของยีนในเมธิล-โลโธฟิกยีสต์
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
อินซูลินเป็นฮอร์โมนที่ผลิตจากตับอ่อน มีหน้าที่ควบคุมระดับน้้าตาลในเลือด ซึ่งอินซูลินที่ออกฤทธิ์ได้จะอยู่ในรูปแบบของอินซูลินแบบมอนอเมอร์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนทั้งหมด 51 ตัว และมีโครงสร้างเป็นเปปไทด์ 2 สาย ปัจจุบันมีการพัฒนาการผลิตอินซูลินให้อยู่ในรูปแบบของรีคอมบิแนนต์อินซูลินที่ผลิตโดยแบคทีเรีย และยีสต์เนื่องจากสามารถผลิตและท้าบริสุทธิ์ได้ง่ายกว่าการสกัดมาจากตับอ่อนของหมูและวัว และในปัจจุบันประเทศไทยมีจ้านวนผู้ป่วยโรคเบาหวานเพิ่มขึ้นทุกปี แต่ยังไม่มีการผลิตอินซูลินภายในประเทศ จึงต้องอาศัยการน้าเข้าจากต่างประเทศทั้งสิ้น งานวิจัยนี้จึงสนใจที่จะน้ารีคอมบิแนนต์ยีสต์Pichia pastoris สายพันธุ์KM71H (TP1) ซึ่งมีพลาสมิดที่มีชุดยีนผลิตรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์(MIP) มาเลี้ยงและเหนี่ยวน้าให้มีการผลิตรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์ซึ่งสามารถตรวจติดตามระดับการแสดงออกได้ด้วยวิธีDot-blot analysis และสามารถวัดปริมาณรีคอมบิแนนต์อินซูลินด้วยวิธีIndirect competitive Elisa นอกจากนี้สามารถตรวจสอบน้้าหนักโมเลกุลของโปรตีนในอาหารเลี้ยงเชื้อได้ด้วยเครื่องวัดมวลโมเลกุล พบว่าอินซูลินที่ผลิตได้มีความ เข้มข้น 16 มิลลิกรัม/ลิตร และมีน้้าหนักโมเลกุลประมาณ 5756.95 ดาลตัน งานวิจัยนี้ได้ท้าบริสุทธิ์รีคอมบิแนนต์อินซูลินออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อโดยใช้สองขั้นตอน ขั้นตอนแรกคือการท้าบริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนประจุลบชนิด SPSepharose Fast Flow และขั้นตอนที่สองคือการใช้Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter ขนาด 10 กิโลดาลตัน จากนั้นรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์ถูกเปลี่ยนให้อยู่ในรูปที่ออกฤทธิ์ได้โดยการท้าให้เกิดปฏิกิริยา การย่อยสลายด้วยเอนไซม์ทริปซิน นอกจากนี้ได้ศึกษาผลของรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์บริสุทธิ์ที่ผลิตจากยีสต์ Pichia pastoris KM17H ต่อการน้าเข้ากลูโคสและการแสดงออกของยีนขนส่งน้้าตาลกลูโคส ประเภทที่ 4 โดยการวัดระดับปริมาณน้้าตาลกลูโคสในอาหารที่ลดลงด้วยเครื่องตรวจวัดระดับน้้าตาลและวัดระดับการผลิตอาร์เอ็นเอน้ารหัสของตัวขนส่งน้้าตาลกลูโคส ประเภทที่ 4 (GULT 4) ในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจหนูชนิด H9c2 (2-1) ด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสที่สามารถติดตามปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้น ณ เวลานั้นๆ โดยอาร์เอ็นเอน้ารหัสของตัวขนส่งน้้าตาลกลูโคสประเภทที่ 4 มีการแสดงออกและผลิต เพิ่มมากขึ้นเมื่อมีการกระตุ้นจากอินซูลิน พบว่า เมื่อมีการกระตุ้นด้วยรีคอมบิแนนต์อินซูลิน ระดับน้้าตาลกลูโคสในอาหารจะลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้นด้วยอินซูลิน และในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วยรีคอมบิแนนต์อินซูลินที่ความเข้นข้น11.20 มิลลิกรัม/ลิตร มีการเพิ่มการแสดงออกของอาร์เอ็นเอน้ารหัสของตัวขนส่งน้้าตาลประเภทที่ 4 ที่ระยะเวลา 3 ชั่วโมง