การผลิตแอนติบอดีสายเดี่ยวที่จำเพาะต่อโปรตีนของไวรัสเด็งกี

บทคัดย่อ

โรคไข้เลือดออกจากการติดเชื้อไวรัสเด็งกีเป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญของประเทศไทย และอีกหลายภูมิภาคทั่ว โลก ในปัจจุบันยังไม่มีวัคซีนที่มีประสิทธิภาพดีในการป้องกัน และไม่มียาที่มีความจำเพาะในการรักษา ดังนั้นการค้นคว้าพัฒนา ยาต้านไวรัสเพื่อการรักษาจึงมีความจำเป็นอย่างยิ่ง เนื่องจากในระยะต้นของการติดเชื้อมีองค์ประกอบของไวรัสที่มีความสำคัญต่อการติดเชื้อได้แก่ โปรตีนผิวของไวรัสที่ใช้ในการจับกับเซลล์เจ้าบ้าน และสารพันธุกรรมของไวรัสที่สำคัญต่อการ เพิ่มจำนวน ดังนั้นทั้งสองส่วนจึงสามารถนำมาใช้เป็นเป้าหมายในการค้นหายาต้านไวรัสได้ โครงการวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์ เพื่อค้นหา และพัฒนาสารต้านไวรัสชนิดสารชีวโมเลกุลโดยมีโปรตีนผิว และสารพันธุกรรมของไวรัสเป็นเป้าหมาย สารชีว โมเลกุลที่นำมาศึกษาได้แก่ แอนติบอดีสายเดี่ยว (human single-chain variable fragment antibodies; HuScFv) และเปปไทด์สายสั้นโดยมีโปรตีนผิวเป็นเป้าหมาย รวมถึงสารจำลองนิวคลีโอไทด์ชนิด morpholinol (oligo-nucleotide mimics) โดยมีสารพันธุกรรมเป็นเป้าหมาย สำหรับการคิดค้น และพัฒนาแอนติบอดีสายเดี่ยว (HuScFv) เพื่อการยับยั้งเชื้อไวรัสเด็งกี่ คณะผู้วิจัยได้คัดเลือก HuScFv จาก phage-displaying library โดยใช้โปรตีนผิว envelope (E) ของไวรัส และอนุภาคไวรัสเป็นแอนติเจนในการคัดเลือก หลังจากการคัดเลือก phage clone จะนำมาเหนี่ยวนำการแสดงออกเพื่อสร้าง โปรตีนก่อนนำมาทดสอบการจับกันกับอนุภาคไวรัสโดยเทคนิค indirect ELISA จากการทดลอง phage clone จำนวน 28 โคลนที่ได้มาจากการคัดเลือกโดยมีโปรตีน E เป็นแอนติเจน และ 13 โคลนที่ได้มาจากการคัดเลือกโดยอนุภาคไวรัสเป็น แอนติเจน พบว่าโคลนที่ได้มาจากการคัดเลือกโดยอนุภาคไวรัสเป็นแอนติเจนมีค่าสัญญาณการจับกันที่ดีกว่า โดยมี 46% (6/13) ที่ได้ค่าการจับกันมากกว่า 1.5 เท่าเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่มีการแสดงออกของโปรตีนในขณะที่โคลนที่ได้มาจากการคัดเลือกโดยมีโปรตีน E เป็นแอนติเจนมีเพียง 3% (1/28) เท่านั้น คณะผู้วิจัยได้ทำการ ทดสอบคุณสมบัติการยับยั้งเชื้อ ไวรัสเด็งกี่ในเซลล์เพาะเลี้ยงของ HuScFv โคลนที่ได้มาจากการคัดเลือกโดยมีโปรตีน E เป็นแอนติเจน คือ no 15A พบว่า -3- HuScFv no.15A ที่ความเข้มข้น 200 ng/?l สามารถลดการติดเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 1, 2, 4 ลงถึง 40-60% แต่ไม่สามารถ ลดการติดเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 3 จากการศึกษาตำแหน่งจับของ HuScFv พบว่าสามารถจับกับ 3 บริเวณบน domain III ของ E ได้แก่ B strand-BC loop, C-C’ loop-C’ strand and F strand-FG loop โดยมีค่าประเมินการจับเท่ากับ -9.459 kcal mol-1 สำหรับการคิดค้น และออกแบบเปปไทด์สายสั้นเพื่อใช้ในการยับยั้งการติดเชื้อไวรัสเด็งกี่คณะผู้วิจัยได้จำลองส่วน หนึ่งของของโปรตีน pre-membrane (prM) เรียกว่า MLH40 (ขนาด 40 กรดอะมิโน) และทดสอบความสามารถในยับยั้ง การติดเชื้อไวรัสในเซลล์เลี้ยง Vero พบว่า MLH40 สามารถลดปริมาณการสร้าง foci ของไวรัสเด็งกี่ได้ทั้ง 4 ซีโรไทป์ โดยมีค่า IC50 อยู่ระหว่าง 24-31 M นอกจากนี้ยังพบว่าสามารถยับยั้งการติดเชื้อในเซลล์เป้าหมายชนิดอื่น คือ A549 และ Huh7 อีกด้วย จากการศึกษากลไกการทำงานของ MLH40 โดยเทคนิค qPCR พบว่าเปปไทด์มีคุณสมบัติในการยับยั้งการจับกัน ระหว่างไวรัสและผิวเซลล์เจ้าบ้าน สำหรับการคิดค้น และออกแบบสารจำลองนิวคลีโอไทด์ (oligo-nucleotide mimics) เพื่อใช้ในการยับยั้งการติดเชื้อไวรัสเด็งกี่ คณะผู้วิจัยเลือกใช้สารจำลองนิวคลีโอไทด์ MO-S3 ซึ่งเป็นสารจำลองชนิด morpholinol ต่อกับตัวพาชนิด octaguanidine dendrimer (vivomorpholinol) โดยออกแบบให้มีความจำเพาะต่อส่วน 3’stem loop (3’SL) ของไวรัส ผลจากการทดลองพบว่า vivo-morpholinol สามารถจับกับสารพันธุกรรมของไวรัสได้อย่าง จำเพาะซึ่งทดสอบด้วยวิธี gel-retardation assay เมื่อทดสอบความสามารถในการยับยั้งการ ติดเชื้อไวรัสพบว่า vivomorpholinol ที่ความเข้มข้น 4 M สามารถลดปริมาณ foci ที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสเด็งกี่ได้ถึง 80% ในเซลล์ Vero และยังสามารถลดการติดเชื้อในเซลล์เป้าหมายอื่น คือ A549 ได้อีกด้วย จากการศึกษากลไกการทำงานของ vivo-morpholinol พบว่ามีคุณสมบัติในการยับยั้งการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของไวรัสแต่ไม่สามารถลดความระดับการโปรตีนได้จากผลการทำ translation assay ผลผลิตสารต้านไวรัสที่ได้จากการโครงการวิจัยนี้มีประสิทธิภาพที่ดีในการยับยั้งการติดเชื้อไวรัสเด็งกี่ใน เซลล์เพาะเลี้ยงซึ้งสามารถนำไปพัฒนาต่อยอดเพื่อผลิตสารต้านไวรัสที่มีประสิทธิภาพเพื่อการรักษาโรคไข้เลือดออกได้ ใน อนาคต

คำสำคัญ