การประเมินความปลอดภัยของการใช้สารสกัดสะเดาด้วยวิธีตรวจผลต่อการเกิดความผิดปกติของสารพันธุกรรม (genotoxicity) ในสิ่งมีชีวิต และพิษต่อพืช (phytotoxicity)

บทคัดย่อ

ชื่อโครงการ การตรวจสอบความเป็นพิษของสารสกัดสะเดาต่อการเกิดความผิดปกติของสารพันธุกรรม ในปลา ชื่อผู้วิจัย รองศาสตราจารย์ ดร.เรณู เวชรัชต์พิมล (หัวหน้าโครงการ) คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยศิลปากร ผู้ช่วยศาสตราจารย์ พนอ อัศวรุจานนท์ (ผู้ร่วมวิจัย) คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ แหล่งทุนอุดหนุนการวิจัย งบประมาณแผ่นดินประจำปี 2551 สถาบันวิจัยและพัฒนา มหาวิทยาลัยศิลปากร ปีที่ดำเนินการสำเร็จ 2559 ประเภทการวิจัย การวิจัยประยุกต์ สาขาวิชา เกษตรศาสตร์และชีววิทยา บทคัดย่อ สารสกัดสะเดา (สะเดาไทย 111TM) มีอะซาดิแรคติน (Azadirachtin; Aza) เป็นสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพพบในเมล็ดของต้นสะเดาในเขตร้อน เป็นสารที่อนุญาตให้ใช้ควบคุมแมลงในการทำเกษตรอินทรีย์ แต่ยังมีข้อกังวลถึงอันตรายต่อปลาเมื่อสารถูกชะลงแหล่งน้ำ งานวิจัยนี้จึงต้องการศึกษาความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรมของสารสกัดสะเดาด้วยเทคนิค Micronucleus Test และศึกษาชนิดปลาที่ใช้เป็นโมเดลในการเฝ้าระวังผลกระทบจากสารสกัดสะเดาและระยะเวลาในการเสื่อมฤทธิ์ของสาร การศึกษาเริ่มจากการหาความเข้มข้นของ CdCl2 ซึ่งเป็นสารก่อมะเร็งเพื่อใช้เป็น positive control และคัดเลือกเซลล์ของปลาดุกอุย (Clarias macrocephalus) 3 ชนิดเพื่อคัดเลือกเซลล์ที่มีความไวและสะดวกในการตรวจหา micronucleus frequencies (MNFs) พบว่า CdCl2 เข้มข้น 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 และ 0.05 mg/L ทุกความเข้มข้นไม่ทำให้ปลาตายหลังจากได้รับนาน 24 ชม. แต่เมื่อเพิ่มเวลาเป็น 48 ชม. พบว่าความเข้มข้น 0.04 และ 0.05 mg/L ทำให้ปลาตาย 10 และ 20% ตามลำดับ จากการตรวจหา MNFs ในเซลล์ 3 ชนิดพบว่าปลากลุ่มที่ได้รับ CdCl2 0.03-0.05 mg/L เป็นเวลา 24 และ 48 ชม. มีค่า MNFs ในเซลล์เม็ดเลือดแดงสูงกว่าปลากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) โดยปลาที่ได้รับ CdCl2 0.03 mg/L เป็นเวลา 24 ชม. ถูกชักนำให้เซลล์เม็ดเลือดแดงมีค่า MNFs สูงกว่ากลุ่มควบคุม 2.28 เท่า เมื่อศึกษาค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ (R2) ระหว่างค่า MNFs กับความเข้มข้นของ CdCl2 พบความสัมพันธ์เชิงบวกสูงในระยะเวลา 24 ชม. โดยเซลล์เม็ดเลือดแดง เซลล์เหงือกและเซลล์ตับมีค่า R2 เท่ากับ 0.8916, 0.9443 และ 0.0407 ตามลำดับ ผลการทดลองพบว่าเซลล์เม็ดเลือดแดงเป็นเซลล์เดี่ยว ๆ ไม่ชิดติดกันต่างจากเซลล์เหงือกจึงง่ายต่อการใช้เป็นโมเดลตรวจความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรม และเลือกใช้ CdCl2 0.05 mg/L เป็น positive control การศึกษาความเป็นพิษเฉียบพลันของสารสกัดสะเดา (สะเดาไทย 111TM) ในปลา 6 ชนิด คือ ปลาดุกอุย (C. macrocephalus) ปลาหมอไทย (Anabas testudineus) ปลานิล (Oreochromis niloticus) ปลาสวาย (Pangasianodon hypophthalmus) ปลากราย (Chitala ornate) และปลานิลแดง (Oreochromis niloticus) เป็นเวลา 24 และ 48 ชม. พบว่าปลาดุกอุยและปลาหมอไทยมีอัตราการรอดชีวิตสูงกว่าปลาชนิดอื่นหลังจากได้รับสารสกัดสะเดาที่มี Aza เข้มข้น 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 และ 0.9 mg/L เป็นเวลา 24 ชม. และ 48 ชม. ส่วนปลาชนิดอื่น ๆ ตายก่อนครบเวลาทดสอบ ค่า LC50 ของ Aza ที่เวลา 24 ชม. ของปลาดุกอุยเท่ากับ 0.71 mg/L และของปลาหมอไทยเท่ากับ 0.83 mg/L ผลการตรวจค่า MNFs ในเซลล์เม็ดเลือดแดง ปลาทั้ง 2 ชนิด พบว่าสารสกัดสะเดาไม่ทำให้ MNFs เพิ่มขึ้นแตกต่างจากกลุ่มควบคุม (P<0.05) และค่า R2 ของปลาดุกอุย (0.9184) สูงกว่าปลาหมอไทย (0.6240) การศึกษาความเป็นพิษของสารสกัดสะเดาในรูปสารบริสุทธิ์ Pure Aza พบว่าความเข้มข้น 0.8, 1.6 และ 3.2 mg/L ไม่เป็นพิษต่อปลาดุกอุยที่ได้รับนาน 24 ชม. และตรวจพบว่า MNFs และ NAFs มีค่าต่ำไม่แตกต่างจากกลุ่มควบคุมลบ (P>0.05) เซลล์เม็ดเลือดแดงปลาดุกอุยจึงเป็นโมเดลที่ดีในการตรวจความผิดปกติของสารพันธุกรรมในแหล่งน้ำ การศึกษาการเสื่อมฤทธิ์ของสารสกัดสะเดาต่อความผิดปกติของสารพันธุกรรม พบว่าสารสกัดสะเดาเข้มข้น 0.8 mg/L ก่อนทำให้เสื่อมฤทธิ์และหลังทำให้เสื่อมฤทธิ์ด้วยวิธีผึ่งแดดนาน 3 และ 7 วัน ไม่พบว่ามีค่า MNFs และ NAFs แตกต่างจากกลุ่มควบคุมลบทั้งในปลาดุกอุยและปลาหมอไทย (P<0.05) เมื่อนำปลาดุกอุยไปทดสอบในภาคสนามในท้องร่องของสวนเกษตรอินทรีย์ โดยพ่นสารสกัดสะเดาตามความเข้มข้นที่แนะนำของผู้ผลิต 20 L ซึ่งมี Aza 1.25 mg/L ตรวจพบค่า MNFs และ NAFs ใกล้เคียงกับปลากลุ่มควบคุมลบ (P<0.05) หลังจากปลาได้รับสาร 1, 3 และ 7 วัน และให้ผลคล้ายกับที่พบในห้องปฏิบัติการ ผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าสารสกัดสะเดาไม่มีความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรมที่ชัดเจน แต่น้ำมันที่เป็นส่วนผสมอาจทำให้ปลาตายถ้าใช้ในระบบปิดและปลาดุกอุยเป็นปลาที่มีความไวในการใช้ทดสอบความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรมในเซลล์เม็ดเลือดแดงด้วยเทคนิค Micronucleus Test เกษตรกรจึงสามารถใช้สารสกัดสะเดาตามคำแนะนำของผู้ผลิตกำจัดแมลงศัตรู ในแปลงเกษตรอินทรีย์ได้ คำสำคัญ สารสกัดสะเดา ปลาดุกอุย ปลาหมอไทย ไมโครนิวเคลียส พิษต่อสารพันธุกรรม ชื่อโครงการ : การคัดกรองชนิดพืชและการประเมินความเป็นพิษของสารสกัดสะเดาต่อความ ผิดปกติของสารพันธุกรรมพืช บทคัดย่อ การทดสอบความไวของพืช 6 ชนิดได้แก่ พลับพลึง (Hymenocalli littoralis Salsb.) กระดุมทอง (Wedelia trilobata L.Hiteh) บัวจีน (Zephyranthes rosea (Speng) Lind.) ว่านมหาลาภ (Eucrosia bicolor Ker. Gawl,) หอมแดง (Allium cepa L var. ascolonium) และหอมหัวใหญ่ (Allium cepa Linn.) กับสารละลายแคดเมียมคลอไรด์ (CdCl2) ความเข้มข้น 0.00, 0.02, 0.03, 0.06 และ 0.09 ppm เป็นเวลา 24 ชั่วโมง นำปลายรากมาเตรียมสไลด์แบบ squash การวิเคราะห์ความไวในการตอบสนองของสารพันธุกรรมต่อสารพิษพิจารณาจากค่า Mitotic index (MI) และ Mitotic aberration (MA) พบว่าพืช 4 ชนิด ได้แก่ พลับพลึง บัวจีน ว่านมหาลาภ และหอมหัวใหญ่ มีผลการตอบสนองในทิศทางเดียวกันคือ ความเข้มข้นของแคดเมียมที่ใช้มีผลเชิงลบต่อการแบ่งเซลล์โดยแสดงค่า MI ลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P ? 0.05) เมื่อความเข้มข้นของแคดเมียมเพิ่มขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม และระหว่างกลุ่มทดลอง สำหรับพืชอีก 2 ชนิดคือ กระดุมทองและหอมแดงไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจน สำหรับค่า MA พบว่ามีค่าเพิ่มขึ้นเมื่อปริมาณแคดเมียมเพิ่มขึ้นซึ่งพบความแตกต่างทางสถิติ (P ? 0.05) เฉพาะกระดุมทอง ว่านมหาลาภ และหอมหัวใหญ่โดยชนิดของ MA ที่พบมากที่สุดได้แก่ disturb จากการคัดเลือกพืช โดยพิจารณาการตอบสนองของสารพันธุกรรมต่อสารพิษจากค่า MI และ MA ซึ่งสามารถคัดเลือกไว้ได้ 2 ชนิด ได้แก่ ว่านมหาลาภและบัวจีน เพื่อนำมาประเมินความไวต่อการตอบสนองของสารพันธุกรรม เปรียบเทียบกับพืชที่นิยมนำมาใช้ในการทดสอบลักษณะนี้คือ หอมหัวใหญ่ โดยศึกษาค่า MI และ MA เมื่อปลายรากได้รับสารละลายแคดเมียม 0.06 ppm เป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง ซึ่งพบว่า เซลล์ของว่านมหาลาภมีการตอบสนองเป็นไปในทิศทางเดียวกับหอมหัวใหญ่คือ มีค่า MI ลดลงและค่า MA เพิ่มขึ้น เมื่อให้สารละลายแคดเมียมเป็นเวลานานขึ้น ส่วนบัวจีนมีการตอบสนองที่ไม่ชัดเจนในกลุ่มทดลอง เมื่อนำบัวจีน ว่านมหาลาภและหอมหัวใหญ่ มาทดสอบกับสารสกัดสะเดาที่มีส่วนประกอบของสาร Azadirachtin 0.00, 0.05, 1.00, 1.50 และ 2.00 ppm ผลการทดลองพบว่าเฉพาะหอมหัวใหญ่และว่านมหาลาภเท่านั้นที่กลุ่มทดลองมีค่า MI ลดลงและค่า MA เพิ่มขึ้นซึ่งต่างจากกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P ? 0.05) การศึกษาการเสื่อมฤทธิ์ของสารสกัดสะเดาความเข้มข้น 2.00 ppm โดยการตากแดดเป็นเวลา 3 วัน และ 7 วัน ผลการทดสอบ Genotoxicity ต่อพืชทดสอบเมื่อพิจารณาจากค่า MI และ MA พบว่าพิษของสารสกัดสะเดาหายไปเมื่อถูกแสงแดดทั้ง 3 วันและ 7 วัน ผลการศึกษา Genotoxicity ต่อพืชทดสอบของน้ำในร่องสวนที่ทำเกษตรอินทรีย์ ภายหลังการฉีดพ่นสารสกัดสะเดาวันแรกวันที่ 2 และวันที่ 3 พบว่า ค่า MI และ MA สูงกว่ากลุ่มควบคุม (น้ำประปา) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าน้ำในร่องสวนดังกล่าวอาจมีสารชนิดอื่นปนเปื้อนซึ่งมีฤทธิ์ส่งเสริมการแบ่งเซลล์และเป็นสาเหตุของความผิดปกติของสารพันธุกรรมด้วย ชื่อโครงการ: การตรวจสอบความเป็นพิษของสารสกัดสะเดาต่อการเกิดความผิดปกติของสาร พันธุกรรมในไส้เดือนดิน ชื่อผู้วิจัย: ผู้ช่วยศาสตราจารย์ปทุมพร เมืองพระ และรองศาสตราจารย์ ดร. เรณู เวชรัชต์พิมล หน่วยงานที่สังกัด: ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยศิลปากร แหล่งทุนอุดหนุนการวิจัย: สถาบันวิจัยและพัฒนา มหาวิทยาลัยศิลปากร ประจำปีงบประมาณ พ.ศ. 2550 . ปีที่เสร็จ: 2552 ส่วนที่ 2 บทคัดย่อ การศึกษาผลของสารสกัดสะเดาทางการค้าชื่อ สะเดาไทย 111 ที่มีสารอะซาดิแรคติน (azadirachtin) ซึ่งเป็นสารออกฤทธิ์ต่อไส้เดือนดิน 2 ชนิดคือ Pheretima peguana และ P. posthumaการศึกษาแบ่งเป็น 2 ส่วน ส่วนที่ 1 ศึกษาผลต่อการรอดชีวิต ส่วนที่ 2 ศึกษาผลต่อความผิดปกติของสารพันธุกรรม ผลการทดสอบสะเดาไทย 111 ต่อการรอดชีวิตของไส้เดือนดิน พบว่าค่า LC50 ในเวลา 48 และ 72 ชั่วโมงของ P. peguana มีค่า 0.259 และ 0.243 ?g/cm2 ตามลำดับ และของ P. posthuma มีค่า 0.026 และ 0.016 ?g/cm2 ตามลำดับ ผลของสะเดาไทย 111 ที่มีต่อความผิดปกติของสารพันธุกรรมของเซลล์ coelomocytes ซึ่งทำหน้าที่เป็นเซลล์ภูมิคุ้มกัน การทดสอบทำทั้งบนกระดาษกรองและดินธรรมชาติ โดยใช้น้ำกลั่นเป็น positive control และแคลเซียมคลอไรด์ความเข้มข้น 0.014 ?g/cm2 เป็น negative control ไส้เดือนดิน P. peguana ทดสอบกับสะเดาไทย 111 บนกระดาษกรอง ที่มีสารอะซาดิแรคตินความเข้มข้น 0.024, 0.047, 0.098, 0.141 และ 0.188 ?g/cm2 และ P. posthuma ทดสอบที่ความเข้มข้น 0.005, 0.012, 0.024, 0.035 และ 0.047 ?g/cm2 เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง ตรวจสอบความผิดปกติของโครโมโซมของเซลล์ coelomocytes ด้วย micronucleus test โดยการนับจำนวน micronucleus, binucleate, trinucleate, necrosis, apoptosis และความผิดปกติของรูปร่างนิวเคลียสจากเซลล์ทั้งหมด 1000 เซลล์ ผลการทดสอบพบว่าเวลา 48 ชั่วโมงไม่มีผลต่อ micronucleus ของเซลล์ coelomocytes ของไส้เดือนดินทั้งสองชนิด แต่เวลา 72 ชั่วโมง มีผลที่ความเข้มข้นต่ำ แต่ไม่ สัมพันธ์กับความเข้มข้น ส่วนจำนวน binucleate ของ P. peguana และ P. posthuma เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) การทดสอบในดินพบว่าระยะเวลาและความเข้มข้นของสะเดาไทย 111 ไม่มีผลต่อการเปลี่ยนแปลงสารพันธุกรรมของเซลล์ coelomocytes ของไส้เดือนดิน แต่ระยะเวลาการได้รับสะเดาไทย 111 มีผลต่อจำนวนรูปร่างนิวเคลียสผิดปกติของเซลล์ coelomocytes ในไส้เดือนดิน P. posthuma โดยความผิดปกติจะเพิ่มขึ้นเมื่อระยะเวลาการได้รับสารนานขึ้น และผกผันกับจำนวนเซลล์ปกติ P. posthuma มีความไวต่อสะเดาไทย 111 มากกว่า P. peguana ทั้งการตรวจสอบบนกระดาษกรองและในดินธรรมชาติ จำนวน binucleate ของเซลล์ coelomocytes สามารถใช้เป็น biomarker ที่เวลา 48 ชั่วโมง ในการตรวจวัดผลของสะเดาไทย 111 ต่อสารพันธุกรรมของไส้เดือนดินได้ การทดสอบความเข้มข้นสะเดาไทย 111 ที่เกษตรกรใช้ในดิน (0.42 มิลลิกรัม/กิโลกรัม) พบว่าไม่มีผลต่อไส้เดือนดิน และสะเดาไทย 111 มีความเป็นพิษมากกว่าอะซาดิแรคตินบริสุทธิ์ การทดสอบการเสื่อมฤทธิ์ของสะเดาไทย 111 เมื่อนำไปตากแดด พบว่าความเข้มข้นเริ่มต้นมีผลต่อการเสื่อมฤทธิ์ และการทดสอบฤทธิ์ตกค้างในน้ำที่อยู่ในร่องสวน พบว่าน้ำในร่องสวนวันที่สองหลังจากฉีดสะเดาไทย 111 ทำให้ P. peguana เกิด binucleate มากกว่าปกติ แตกต่างจากกลุ่มควบคุม และระยะเวลาที่ได้รับสาร 21 วัน ทำให้เกิด micronucleus มากกว่ากลุ่มควบคุม แต่หลังจากได้รับสาร 21 วัน พบว่าจำนวน micronucleus ไม่แตกต่างจากกลุ่มควบคุม จากการทดลองสรุปได้ว่าการใช้สะเดาไทย 111 ในระดับที่แนะนำให้เกษตรกรใช้ในสวนเกษตร ไม่มีผลการเปลี่ยนแปลงสารพันธุกรรมของไส้เดือนดิน และมีความปลอดภัยในการใช้กำจัดแมลงได้ คำสำคัญ: ไส้เดือนดิน, อะซาดิแรคติน, coelomocytes, genotoxicity, binucleate, micronucleus ชื่อโครงการ การคัดเลือกพืชที่ไวต่อสารสกัดสะเดาเพื่อใช้ประเมินความเป็น พิษของสารเคมีปนเปื้อนในสวนเกษตรอินทรีย์ ชื่อผู้วิจัย ผศ. วิไลภรณ์ บุญญกิจจินดา และ นางนงนุช เอื้อวงศ์ คณะวิชา วิทยาศาสตร์ ภาควิชา ชีววิทยา มหาวิทยาลัยศิลปากร สาขาวิชา พฤกษศาสตร์ แหล่งทุนอุดหนุนการวิจัย สถาบันวิจัยและพัฒนา มหาวิทยาลัยศิลปากร ปีที่เสร็จ 2553 บทคัดย่อ จากการประเมินความเป็นพิษของสาร Azadirachtin (Aza)ในสารสกัดสะเดาไทย(Azadirachta siamensis Valeton) ที่ความเข้มข้น 0, 33, 66, 99, 132, และ 165 ppm โดยแช่เมล็ดเป็นเวลา 1 คืน พบว่าในพืช 17 ชนิด มีเมล็ด 5 ชนิด ได้แก่ ผักกาดหอม ถั่วเขียว ถั่วพุ่ม ถั่วดำ หญ้าข้าวนก ที่อัตราการงอกและการเจริญของรากและต้นลดลงเป็นลำดับ เมื่อได้รับสาร Aza ความเข้มข้นเพิ่มขึ้น (R2 > 0.700) ค่า LC50 ของการงอก, EC50 ของความยาวรากและต้นมี ค่าต่ำ เมล็ดพืชเหล่านี้จึงใช้เป็นดัชนีชีวภาพ (bioindicator) แสดงถึงการปนเปื้อนของสารสกัดสะเดาได้และใช้เป็นพืชทดสอบความเป็นพิษของสารในการทดลองต่อไป โดยใช้ค่าเปอร์เซ็นต์การงอก หรือความยาวรากหรือความยาวต้น เป็นดัชนีชี้วัด (biomarker) การแช่เมล็ด ทั้ง 5 ชนิดที่คัดเลือกไว้ในสาร Aza ที่ความเข้มข้น 165 ppm ที่ได้รับแสงแดดโดยตรงนาน 3,7 และ 11 วัน พบว่า การได้รับแสงแดดโดยตรงเป็นเวลานานขึ้นทำให้ความเป็นพิษของสาร Aza ต่อพืชมีแนวโน้มลดลง การแช่เมล็ดในน้ำที่เก็บจากแหล่งน้ำบริเวณต่างๆในสวนเกษตรอินทรีย์ที่ยังไม่ได้ฉีดและหลังฉีดด้วยน้ำสะเดาหมัก พบว่ามีเพียงเมล็ดถั่วดำเท่านั้นที่การงอกและการเจริญถูกยับยั้ง และพบว่า เมล็ดผักกาดหอม เมล็ดข้าวนกและถั่วเขียวถูกยับยั้งมากขึ้นเมื่อได้รับแคดเมียม (Cd) ความเข้มข้นสูงขึ้น จึงสามารถใช้พืชทั้งสามเป็นดัชนีชีวภาพ ทดสอบความเป็นพิษของแคดเมียมโดยใช้ อัตราการงอก ความยาวของรากและของต้นเป็นดัชนีชี้วัด

คำสำคัญ