การโคลนและวิเคราะห์การแสดงออกของยีนแอนทรานิเลทซินเทสชนิดแอลฟ่าในต้นกระท่อม
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
เอนไซม์ anthranilate synthase (AS) ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยน chorismate เป็น anthranilate ในชีวสังเคราะห์ของ tryptophan และเป็นเอนไซม์ที่กำหนดอัตราของชีวสังเคราะห์ tryptophan โดย anthranilate ที่ได้จะถูกป้อนสู่ชีวสังเคราะห์ของ TIA ในฐานะสารตั้งต้น สำหรับการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาชีวสังเคราะห์ในขั้นแรกๆ ของสารมัยตรากัยนีน จึงมีเป้าหมายเพื่อโคลนและศึกษาคุณลักษณะของยีน AS จากใบกระท่อม อาศัยเทคนิค Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) ผลการทดลองพบว่ายีน MSASA ปรากฏ 2 รูปแบบ คือ MSASA1 และ MSASA2 ข้อมูลที่ได้จาก cDNA พบว่ายีน MSASA1 และ MSASA2 มีส่วน open reading frame (ORF) ขนาด 1,851 คู่เบส และ 1,728 คู่เบส และถอดรหัสเป็นลำดับกรดอะมิโนได้ จำนวน 616 และ 575 หน่วยอะมิโน ตามลำดับ เมื่อวิเคราะห์สายกรดอะมิโนพบว่า NH2-termini ของ MSASA1 และ MSASA2 ประกอบด้วย chloroplast transit peptide จำนวน 69 และ 36 หน่วยอะมิโน ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบลำดับความเหมือน (identity) ระหว่างกลุ่มเอนไซม์ AS ?-subunit (ASA) พบว่า MSASA มีค่าความเหมือนระหว่าง 67-85% กับ ASA จากพืชอื่นๆ การเหนี่ยวนำการแสดงออกของยีน MSASA1 สายเต็ม ใน E. coli ทำได้โดยการสร้างเชื้อ E. coli ที่มีพลาสมิด pQE30-Xa-FMSASA1 และเหนี่ยวนำการสร้างโปรตีนด้วยสาร isopropyl-?-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ความเข้มข้น 0.1 มิลลิโมลาร์ ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลานาน 5 ชั่วโมง จากนั้นนำเอนไซม์ recombinant AS ?-subunit isoform 1 มาแยกให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์ Ni-NTA และ Sephacryl S-100 ตามลำดับ มวลโมเลกุลที่ปรากฏบน SDS-PAGE พบว่า recombinant AS ?-subunit isoform 1 มีขนาดประมาณ 68 กิโลดาลตัน และมวลโมเลกุลที่ปรากฏบน Sephacryl S-400 มีขนาดประมาณ 550 กิโลดาลตัน การศึกษาคุณสมบัติทางจลนศาสตร์ของเอนไซม์ โดยวัดการทำงานของเอนไซม์ recombinant AS ?-subunit isoform 1 ในปฏิกิริยาที่ขึ้นกับแอมโมเนีย โดยใช้เทคนิค high performance liquid chromatography พบว่าเอนไซม์ทำงานได้ดีที่ pH 9 และที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส ค่า Km ของ chorismate และ NH4Cl มีค่าเท่ากับ 144 ไมโครโมลาร์ และ 125 ไมโครโมลาร์ และค่า Vmax ของ chorismate และ NH4Cl เท่ากับ 0.46 พิโคเคทาลต่อมิลลิกรัมโปรตีน และ 0.87 พิโคเคทาลต่อมิลลิกรัมโปรตีน ตามลำดับ สำหรับการศึกษาผลการยับยั้งแบบย้อนกลับโดย L-tryptophan พบว่าการทำงานของเอนไซม์ recombinant AS ?-subunit isoform 1 ถูกยับยั้งได้ด้วย L-tryptophan แต่เมื่อเพิ่มความเข้มข้นของ chorismate ในปฏิกิริยา กลับพบว่ามีผลทำให้ L-tryptophan ยับยั้งเอนไซม์ได้น้อยลง ผลการทดลองนี้จึงสรุปได้ว่าความเข้มข้นของสารตั้งต้นมีผลต่อการควบคุมแบบย้อนกลับโดย L-tryptophan