การพัฒนาสารบริสุทธิ์จากนมแมวแดงในการทำให้เซลล์มะเร็งเต้านมตายแบบอะพอพโทซิส

บทคัดย่อ

หัวข้อวิจัย การพัฒนาสารบริสุทธิ์จากนมแมวแดงในการทำให้เซลล์มะเร็งเต้านมตายแบบ อะพอพโทซิส ผู้ดำเนินการวิจัย รศ.ดร.พญ.รัตนา บรรเจิดพงศ์ชัย ที่ปรึกษา ศ.ดร.ปรัชญา คงทวีเลิศ หน่วยงาน ภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ ปี พ.ศ. 2560 การวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ดังนี้ ตรวจสอบฤทธิ์ของสารบริสุทธิ์จากพืชนมแมวแดง (Cyathostemma argenteum) ในการเหนี่ยวนำเซลล์มะเร็งมนุษย์ให้เซลล์ตายแบบอะพอพโทซิส โดยใช้เซลล์มะเร็งเพาะเลี้ยงของเต้านมและตับเป็นแบบจำลองในการศึกษา และศึกษากลไกที่เกี่ยวข้อง ผลของการใช้สารบริสุทธิ์จากพืชนมแมวแดงร่วมกับยาเคมีบำบัดปัจจุบัน และ Smac mimetic เครื่องมือที่ใช้ในการทำการทดลองได้แก่ กล้องจุลทรรศน์ phase contrast microscopy, fluorescence microscopy, flow cytometry, fluorescence plate reader, vertical electrophoresis equipment, and real-time RT PCR machine การวิเคราะห์ทางสถิติใช้การวิเคราะห์ด้วยวิธี Kruskal Wallis และการเปรียบเทียบระหว่าง 2 กลุ่มใช้ Dunn’s test หรือ Mann-Whitney U test การทดลองทำ 3 ซ้ำ และทำ 3 ครั้ง ค่าความสำคัญทางสถิติ เป็นดังนี้ *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 ผลการทดลองเป็นดังต่อไปนี้ สารบริสุทธิ์ที่ได้คือ Calomelanone เป็นพิษต่อเซลล์มะเร็งตับ HepG2และมะเร็งเต้านม MCF-7 และ MDA-MB-231 แต่มีความเป็นพิษน้อยในเซลล์เม็ดเลือดขาวปกติ (PBMCs) และเซลล์สร้างเส้นใยปกติจากหนู NIH3T3 อย่างไรก็ตาม ยาหรือสารยับยั้ง tyrosine kinase หรือ growth factor receptor ได้แก่ Soferotinib, Imabtinib และ Smac mimetic เช่น BV6 และยาเคมีบำบัด doxorubicin ยับยั้งการเจริญเติบโตและการแบ่งตัวเพิ่มจำนวนในความเข้มข้นที่ค่า IC50 ต่ำมาก เมื่อเทียบกับสารบริสุทธิ์จากพืช calomelanone เซลล์ U937 cells มีความไวต่อสาร calomelanone มากที่สุด เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์มะเร็งด้วยกัน เป็นดังนี้ U937 > HepG2 > MDA-MB-231 > normal PBMC2 และ NIH3T3 cells. การตายของเซลล์เป็นการตายแบบอะพอพโทซิส โดยใช้ annexin V/propidium iodide (PI) และเทคนิค flow cytometry การย้อมดีเอ็นเอของเซลล์ด้วย PI และดูรูปร่างด้วยกล้องจุลทรรศน์ fluorescence microscopy จะพบลักษณะของเซลล์แบบอะพอพโทซิส คือนิวเคลียสมีการหดแน่น และการแตกตัวของเซลล์ ได้เป็น apoptotic bodies นอกจากนี้ วิถีการสื่อสัญญาณการตายแบบอะพอพโทซิสของเซลล์ HepG2, MCF-7 และ MDA-MB-231 คล้ายกัน คือ ผ่านทางวิถีภายในและวิถีภายนอก จากหลักฐาน (1) การสูญเสียศักย์ไฟฟ้าที่เยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียชั้นนอก (mitochondrial transmembrane potential, MTP) การเพิ่มการทำงานหรือกัมมันตภาพของ caspase-9 ซึ่งอยู่เหนือและส่งต่อสัญญาณไปยัง caspase-3 ผ่านทางการสื่อสัญญาณทางไมโทคอนเดรีย (2) การกระตุ้นกัมมันตภาพของ caspase-8 ซึ่งจัดเป็นตัวตั้งต้น (initiation caspase) การกระตุ้นผ่านทางวิถีภายนอกและวิถีภายใน ในปฏิกิริยาโปรตีโอไลซิสของเอนไซม์ caspase-8 ที่มีซับสเตรตเป็น caspase-3 และโปรตีน Bid เมื่อเกิดการตัดให้สั้นลง จะทำให้ caspase-3 ว่องไว ทำงานต่อไป ส่วนโปรตีน Bid สั้นลง เรียกว่า truncated Bid (tBid) ซึ่งจะสอดคล้องกับหลักฐานว่าเป็นวิถีภายนอก สุดท้าย เอนไซม์ caspase-3 ถูกกระตุ้น ในเซลล์มะเร็งเต้านมทั้ง MCF-7 และ MDA-MB-231 แต่กัมมันตภาพของเอนไซม์คาสเพส-8 ไม่สูงขึ้น สำหรับภาวะเครียดร่างแหเอนโดพลาซึม (endoplasmic reticulum, ER) มีหลักฐานว่า เกิดขึ้นในการตายของเซลล์มะเร็ง HepG2 ส่วนมะเร็งชนิดอื่นๆ ได้แก่ MDA-MB-231 และ MCF-7 ผลยังไม่ชัดเจน จาก histogram ดูเหมือนจะมีการเพิ่มขึ้น (shift) ของ Rhod-2 AM และ Fluo-3 AM ซึ่งเป็นเครื่องหมายของแคลเซียมไอออนในไมโทคอนเดรียและไซโทซอลตามลำดับ รูป histogram ของแต่ละสีของ fluorescence ไม่ไปด้วยกันกับค่าเฉลี่ยที่แสดงเป็นกราฟแท่ง อาจจะเนื่องจากเวลาที่ใช้บ่ม ความเข้มข้นของสาร calomelanone และปัจจัยที่ควบคุมไม่ได้ คือการที่เครื่อง flow cytometer เสีย ระดับการตรวจหา ในการทำให้ครบ 3 ครั้งในสภาวะเดียวกัน ค่าที่ได้เป็นของ 2 เครื่อง flow cytometer สำหรับวัฎจักรเซลล์ที่มีความผิดปกติ จะพบว่า มีการหยุดที่ G1 (G1 arrest) ซึ่งพบในเซลล์ MDA-MB-231 พบเซลล์ใน sub-diploid และระยะ G1 เพิ่มขึ้นที่ IC10 และร้อยละของเซลล์ในระยะ S และ G2/M ลดลง การแสดงออกของยีน atm, atr และ noxa เพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นในเซลล์ MCF-7 และ MDA-MB-231 ส่วนการแสดงออกของโปรตีน ได้แก่ โปรตีน bim, bad เพิ่มขึ้น ระดับ Cyclin D ลดลงตามความเข้มข้นของสาร ปกติ Cyclin D จะอยู่ร่วมกับโปรตีนอื่นเป็นโปรตีนเชิงซ้อน (protein complexes) กับโปรตีน CDK2/4 ควบคุมการดำเนินไปของวัฏจักรเซลล์ ระดับที่ต่ำของ cyclin D ป้องกันเซลล์ไม่ให้เข้าระยะ S จากการที่เซลล์อยู่ในระยะ G1 การสื่อสัญญาณของการตายแบบอะพอพโทซิสอาจจะเกิดจากการคุยข้ามกับวิถีการสื่อสัญญาณอื่นด้วย ซึ่งไปสู่การวัดหาระดับ phospho-epidermal growth factor receptor (EGFR) และ phospho-extracellular regulated kinase (ERK) หรือ mitogen activated kinase (MAPK) วิถีเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการอยู่รอดชีวิตของเซลล์ การแบ่งตัวเพิ่มจำนวน การเติบโตของเซลล์ และการเกิดเป็นก้อนทูเมอร์ ระดับของฟลูโอเรสเซนส์ที่ไปเชื่อมกับ EGFR และ ERK ลดลงตามความเข้มข้นของสาร calomelanone โดยสรุป สาร calomelanone เป็นสารบริสุทธิ์จากพืชนมแมวแดง ซึ่งสามารถเหนี่ยวนำให้เซลล์มะเร็งตายแบบอะพอพโทซิสผ่านทางวิถีต่างๆ (วิถีภายในและวิถีภายนอก) และโมเลกุลโปรตีนต่างๆ (Bim, Bad) ผ่านทางการแสดงออกของยีน เช่น noxa, atm, atr โมเลกุลเหล่านี้สามารถใช้เป็นเป้าหมายในการฆ่าเซลล์มะเร็ง ยกตัวอย่างเช่น หากเซลล์มะเร็งมีการแสดงออกที่สูงของโปรตีน Bid และ caspase-8 การใช้ยา หรือ สารคล้ายกับเอนไซม์ caspase-8 เพื่อกระตุ้นให้เซลล์ตายแบบอะพอพโทซิส หรือใช้สาร z-VAD-fmk ซึ่งเป็นสารยับยั้งเอนไซม์ caspases เกือบทุกชนิด เพื่อเหนี่ยวนำให้เซลล์เกิดการตายแบบเน็คคร็อพโทซิสแทน เซลล์มะเร็งที่มีการแสดงออกที่สูงของโปรตีนในกลุ่ม BH3-only เช่น โปรตีน Bim, Bad, Noxa การใช้ยาฆ่าเซลล์มะเร็งโดยใช้ยาในกลุ่มที่คล้ายกับ และสามารถออกฤทธิ์เหมือนโปรตีนที่มีโดเมน BH3 ทำให้สามารถเป็นเป้าหมายในการยับยั้งการตายของเซลล์ หรือทำให้เซลล์ตายโดยวิถีการตายอื่นได้ เช่น เน็คคร็อพโทซิส

คำสำคัญ