การค้นหากระบวนการดื้อยา Tigecycline ของเชื้อ Acinetobacter baumannii ที่แยกได้จากผู้ป่วยไทย

บทคัดย่อ

การค้นหากระบวนการดื้อยา Tigecycline ของเชื้อ Acinetobacter baumannii ที่แยกได้จากผู้ป่วยไทย ( Identification of Mechanisms of Tigecycline Resistance in Thai Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii) ทุนวิจัยประจำปีงบประมาณ 2556 ผศ.ดร. ผดุงศรี ดับส์ (Padungsri Dubbs) ภาควิชาจุลชีววิทยา และหน่วยวิจัยโรคอุบัติใหม่ และอุบัติซ้ำแบคทีเรีย บทคัดย่อ การดื้อยาของ Acinetobacter baumannii ต่อยา Tigecycline ส่วนใหญ่เป็นผลการที่เชื้อใช้ Efflux pump ในการขับยาออกจากเซลล์ของแบคทีเรีย ซึ่งในกรณีนี้เชื้อมักดื้อยาปฏิชีวนะหลายกลุ่มของยา เรียกว่า multidrug-resistance bacteria เนื่องจากการขับยาโดยใช้ Efflux pump มักจะไม่จำเพาะต่อยาตัวใดตัวหนึ่ง แต่จากการศึกษาได้รับยีนดื้อยาหลายตัวร่วมกัน โดยเฉพาะในกรณีที่เป็น multidrug-resistance bacteria ในการทดลองหาความไวของยาต่าง ๆ ต่อ เ ชื้ อ Acinetobacter baumannii random transposon mutagenesis เพื่อหายีนที่เกี่ยวข้องในการแสดงออกของ phenotype ได้มีผู้ใช้วิธี นี้ กับ Acinetobacter baumannii (Smith, Gianoulis et al., 2007) โ ดยใช้ EZ::TN Transposome system from Epicentre กับเชื้อ Acinetobacter baumannii ATCC17978 สำหรับ kit นี้ ใช้วิธีถ่ายทอด transposon โดยการทำ transformation แต่จากการทดลองนี้พบว่า transformation efficiency ของ clinical isolate Aci25 ได้ผลไม่เป็นที่น่าพอใจ จึงเลือกใช้พลาสมิดที่มีความสามารถในการ conjugation แทนในการทดลองแรกๆได้ใช้พลาสมิด pUT mini-Tn5 lacZ1 or pUT mini-Tn5 ?lacZ ในการทำ transposon mutagenesis ในสายพันธุ์ Aci25 แต่เนื่องจากไม่ได้ exconjugant ที่ต้องการจึงได้เปลี่ยนมาใช้ pBAMD 1-2 ที่มี miniTn5 ที่มียีนดื้อยา Kanamycin พลาสมิดนี้ถูก construct มาเพื่อใช้ในเชื้อ Pseudomonas putida (Aranda et al., 2010) พบว่าพลาสมิดนี้สามารถนำมาใช้ในการทำ transposon mutagenesis ใน A. baumannii โดยพบ exconjugant 12 โคโลนี ที่มี miniTn5 insert อยู่ในยีนที่น่าจะเกี่ยวข้องกับการดื้อยา Tigecycline โดยจากค่า Etest MIC สามารถแบ่งเชื้อได้เป็น 4 กลุ่ม คือ กลุ่มที่หนึ่งมีค่า MIC ลดลง 1.3 เท่า (MIC = 6 ?g/ml) ได้แก่เชื้อ W1(2), T5(5), AN26(1), Z11(10) และ L10(1) กลุ่มที่สองมีค่า MIC ลดลง 2 เท่า (MIC = 4 ?g/ml) ได้แก่เชื้อ T4(2) กลุ่มที่สามมีค่า MIC ลดลง 2.6 เท่า (MIC = 3 ?g/ml) ได้แก่เชื้อ TT6(4), Z3(1), และ L11(3) กลุ่มที่สี่มีค่า MIC ลดลง 5.6 เท่า (MIC = 1.5 ?g/ml) ได้แก่เชื้อ Z9(3) โดยเมื่อเทียบผล Etest MIC interpretive criteria ของเชื้อนี้ถือค่าเป็น susceptible (MIC ? 2 ?g/ml) หมายเหตุไม่ได้ทำ Etest MIC กับเชื้อ Z13(2) แต่ถ้าอ่านค่าผลความไวของเชื้อโดยใช้ interpretive criteria ของ disc diffusion test จะอ่านผลของเชื้อ exconjugant ทุกตัวเป็น susceptible (inhibition zone ? 13 mm) ความแตกต่างระหว่างผล interpretive susceptibility results ของทั้งสองวิธีอาจเนื่องมาจากค่า Tigecycline Etest MIC อาจให้ค่าที่สูง เนื่องจากมีรายงานว่าค่า Etest MIC มีค่าสูงกว่า ค่า MIC ที่ได้จาก microbroth dilution เนื่องจาก mutant ที่ได้มีค่า MIC ลดลงตั้งแต่ 1.3 เท่า ถึง 5.6 เท่า ผลการทดลองนี้ suggest ว่ามียีนหลายยีนที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยา tigecycline โดยจะมีผลให้เชื้อลดระดับการดื้อยาต่างกัน โดยผู้วิจัยได้เลือก mutant Z9(3) เพื่อนำมาศึกษาต่อเนื่องจากค่า Etest MIC ลดลงจนมีผลเป็น susceptible มาท าการ cloning DNA fragment ที่มี miniTn5 insert อยู่เพื่อท าการ identify ยีนที่เกี่ยวข้องในการดื้อยา Tigecycline จากการทำ qRT-PCR เพื่อหาปริมาณ transcript ของยีนที่เกี่ยวข้องกับ A. baumannii efflux pump คือ adeB adeG adeJ และ abeM พบว่า ค่าระดับของ adeB transcript ของ Aci25 สูงขึ้นกว่าระดับเฉลี่ยรวมของเชื้อ susceptible strain Aci14 Aci16 Aci85 และ Aci93 เล็กน้อยอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเลี้ยงเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีและไม่มี Ciprofloxacin ส่วนค่าระดับของ adeJ transcript ของ Aci25 สูงขึ้นกว่าระดับเฉลี่ยรวมของเชื้อ susceptible strain Aci14 Aci16 Aci85 และ Aci93 เล็กน้อยอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ เมื่อเลี้ยงเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี Ciprofloxacin เท่านั้น สำหรับค่า ระดับของ adeG และ abeM transcript ของ Aci25 มีค่าใกล้เคียงกับระดับเฉลี่ยรวมของเชื้อ susceptible strain ผลของการเพิ่มค่าระดับ transcript ของ adeB และของ adeJ ในภาวะที่มี Ciprofloxacin สอดคล้องกับผลการศึกษาก่อนหน้านี้ (Palpasa et al., unpublished results) โดยวัดระดับ Ciprofloxacin accumulation ใน Aci25 ในภาวะที่มีหรือไม่มี efflux pump inhibitor, CCCP (Carbonyl cyanide M-chlorophenylhydrazone) ดังรูปที่ 13 จากผลการทดลองทั้งหมด suggest ว่า AdeABC และ AdeIJK อาจมีส่วนเกี่ยวข้องร่วมกับการ mutation ของ gyrA และ parC QRDR (Palpasa et al., unpublished results) ในการดื้อยา Ciprofloxacin ส่วนการดื้อยา Tigecycline นั้นในการศึกษานี้ยังสรุปได้ไม่แน่นอนแต่ไม่น่าจะเป็นกลไกหลัก ในการดื้อยาของ Aci25

คำสำคัญ