การประยุกต์เทคนิคคริสเปอร์แคสในการสร้างอ้อยพันธุ์ทนดินเค็ม (ปีที่ 2)
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
โครงการนี้ มีจุดประสงค์เพื่อปรับปรุงพันธุ์อ้อยให้มีความทนทานต่อความเค็มเพิ่มขึ้นโดยใช้เทคนิคการแก้ไขยีนคริสเปอร์แคสด้วยแนวทางการแก้ไขแบบสุ่มเพื่อคัดเลือก โดยขอบเขตของการวิจัยจะเป็นการถ่ายโอนระบบคริสเปอร์ให้เกิดการแก้ไขยีนแบบสุ่มภายในจีโนมของอ้อยพันธุ์ KK3 และคัดเลือก callus หรือต้นที่ทนทานต่อความเค็ม แล้วจึงตรวจสอบติดตามว่ายีนที่แก้ไขนี้คือยีนใดบ้าง งานวิจัยดำเนินการโดยถ่ายพลาสมิด RG7pDE-SaCas9 ซึ่งเป็นพลาสมิดของระบบ CRISPR/Cas ที่มี target sequence เป็นแบบสุ่มสำหรับแก้ไขยีนในอ้อยคือ เข้าสู่แคลลัสอ้อยโดยวิธีการใช้อะโกรแบคทีเรียมเป็นพาหะแล้วคัดเลือกแคลลัสบนอาหารคัดเลือกที่เติมสารปฏิชีวนะ cefotaxime ร่วมกับสารปฏิชีวนะ G418 ซึ่งได้แคลลัสที่รอดชีวิตและสามารถพัฒนาเป็นต้นใหม่ได้จำนวนทั้งสิ้น 458 สายต้น และเมื่อตรวจยืนยันการมีอยู่ของ Cas9 โดยการทำ PCR ด้วยไพรเมอร์ที่จำเพาะ พบว่าสามารถตรวจพบ Cas9 ได้ใน 221 สายต้น และเมื่อนำต้นที่ตรวจพบ Cas9 มาทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะกับ sgRNA ที่ออกแบบให้มีลำดับเบสแบบสุ่ม พบว่า ตำแหน่งจับของ sgRNA ในจีโนมอ้อยมีความหลากหลาย ซึ่งแสดงว่า sgRNA มีลำดับเบสแบบสุ่มจริง ต้นที่ได้ทั้งหมด 458 ต้น ได้นำมาเพาะเลี้ยงแต่ละสายต้นให้แตกกอเพื่อเพิ่มจำนวนชุดของประชากร แล้วนำไปใช้ในการคัดเลือกลักษณะทนเค็ม โดยย้ายต้นกล้าอ้อยที่พัฒนาสมบูรณ์แล้วออกปลูกในสารละลายธาตุอาหารสูตร 1/5 Hoagland ที่เติม NaCl 0.5-1.0 % พบว่า จากการปลูกทดสอบจำนวน 90 สายต้น สามารถคัดเลือกต้นทนเกลือโซเดียมคลอไรด์จำนวน 23 สายต้น คิดเป็นร้อยละ 25.5 โดยที่ความเข้มข้นเกลือ 0.75 เปอร์เซ็นต์ พบจำนวน 13 สายต้น และที่ความเข้มข้นเกลือ 1.0 เปอร์เซ็นต์ พบจำนวน 20 ต้น โดยในจำนวนนี้มี 10 สายต้นที่ทนเกลือได้ทั้งสองระดับ จากนั้นได้สกัดจีโนมิคดีเอ็นเอจากต้นที่ทนเค็มเพิ่มมากขึ้น และทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะกับ sgRNA เพื่อนำผลผลิตปฏิกิริยา PCR ไปวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ แล้วนำสำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้ ไป BLAST กับฐานข้อมูลนิวคลีโอไทด์ของ GenBank และตรวจสอบลำดับเบสบริเวณยีนที่ได้จากการ BLAST เพื่อบ่งชี้ยีนที่เกิดการแก้ไขแล้วทำให้อ้อยแสดงลักษณะทนเค็ม