การพัฒนาวิธีตรวจหาเชื้อ Pasteurella multocida serotype B:2 ในโค กระบือ ด้วยเทคนิค Loop mediated isothermal amplification (LAMP)

บทคัดย่อ

ที่มาของการศึกษา: เชื้อแบคทีเรีย Pasteurella multocida ซีโรไทป์ B:2 ก่อให้เกิดโรคเฮโมรายิกเซพติซีเมีย (Haemorrhagic septicemia, HS) ในโคกระบือ ประเทศไทยพบการระบาดในภาคเหนือและตะวันออกเฉียงเหนือ สัตว์ป่วยมีอาการรุนแรงและตายภายใน 1-2 วัน การวินิจฉัยโรคที่รวดเร็วจะช่วยเพิ่มอัตราการรอดชีวิตและควบคุมการระบาดของโรค เทคนิค Loop mediated isothermal amplification (LAMP) ซึ่งให้ผลการทดสอบที่รวดเร็วและสามารถตรวจผลได้ด้วยตาเปล่าจึงถูกพัฒนาในการศึกษาครั้งนี้เพื่อเป็นทางเลือกในการตรวจหาโรค HS วิธีการ: ออกแบบไพรเมอร์ที่จำเพาะกับเชื้อ P. multocida ซีโรไทป์ B:2 ด้วยโปรแกรม PrimerExplorer V4 (Fujitsu?, Japan) ใช้ลำดับพันธุกรรมต้นแบบขนาด 760 bp ตาม Townsend และคณะ (1998) นำไพรเมอร์มาทดสอบหาสภาวะที่เหมาะสม ความไว และความจำเพาะ จากนั้นทดสอบกับตัวอย่างเชื้อที่เก็บรวบรวมไว้ ณ สถาบันสุขภาพสัตว์แห่งชาติ จำนวนทั้งสิ้น 30 isolates และทดสอบกับเชื้อที่แยกจากตัวอย่างสวอปบริเวณ nasopharyngeal ของโคและกระบือจากโรงฆ่าสัตว์ที่ภาคเหนือและตะวันออกเฉียงเหนือจำนวน 100 ตัวอย่าง ผล: LAMP reaction ประกอบด้วย 10x ThermoPol? reaction buffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, pH 8.8) 2.5 ?l 5 mM MgSO4 1 ?l 5 M Betaine 5 ?l 10 mM dNTPs 1 ?l 20 mM MnCl2 0.6 ?l 500 ?M Calcein 1.25 ?l ไพรเมอร์ 6 ตัว ดังตาราง Bst DNA polymerase 1 ?l DNA 2 ?l DW 3.65 ?l ได้ปริมาณสุดท้าย 25 ?l สภาวะที่เหมาะสมคืออุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 นาที ความไวคือ 104 CFU/ml ความจำเพาะต่อเชื้อ P. multocida ซีโรไทป์ B และ A ผลการทดสอบกับเชื้อ 30 isolates ให้ผลบวกทั้งหมด ส่วนตัวอย่างสวอปที่เก็บจากโรงฆ่าไม่สามารถเพาะแยกเชื้อ P. multocida จึงไม่ได้ทำการทดสอบด้วยเทคนิค LAMP สรุป: เทคนิค LAMP ในการทดลองครั้งนี้สามารถตรวจคัดกรองเชื้อ P. multocida ออกจากเชื้อแบคทีเรียชนิดอื่นได้ ใช้เวลารวดเร็ว และเห็นผลด้วยตาเปล่าได้ แต่ยังไม่สามารถแยกซีโรไทป์ B ได้

คำสำคัญ