การพัฒนาเวกเตอร์ไวรัสพืชสำหรับการผลิตโปรตีนบำบัดโรคของคนในพืช
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
ไวรัสใบด่างแตงกวามีสารพันธุกรรมเป็น RNA สายเดี่ยว 3 สาย โดยสารพันธุกรรมของไวรัสเกิดการแสดงออกและเพิ่มจำนวนตามการเจริญของพืชได้อย่างมีประสิทธิภาพ จากคุณสมบัติดังกล่าว สารพันธุกรรมของไวรัสใบด่างแตงกวา ถูกนำมาพัฒนาเป็นพลาสมิดพาหะในการถ่ายโอนยีนเข้าสู่พืช การทดลองนี้มีวัตถุประสงค์ที่จะพัฒนาพลาสมิดพาหะไวรัสใบด่างแตงกวา (Cucumber mosaic virus, CMV) เพื่อใช้เป็นพาหะในการแสดงออกของยีนโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ซึ่งใช้เป็นโปรตีนเครื่องหมายในการถ่ายโอนยีน เพราะไม่เป็นพิษต่อเซลล์พืช และไม่ต้องการสารอื่นเพื่อช่วยในการตรวจสอบ เนื่องจากสามารถมองเห็นเป็นสีเขียวได้ภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต และศึกษาวิธีการ Agroinfiltration ในการถ่ายโอนยีนเข้าสู่ต้นยาสูบเพื่อให้ยีนมีการแสดงออกแบบชั่วคราว (Transient expression) พลาสมิดที่ใช้ในงานวิจัยนี้ได้แก่ pGEM-GFP และ qMCSdelQAN ซึ่งมีขนาดประมาณ 3,750 และ 6,000 คู่เบส โดยพลาสมิด pGEM-GFP เป็นพลาสมิดที่มียีนผลิตโปรตีนเรืองแสงสีเขียว และพลาสมิด qMCSdelQAN เป็นพลาสมิดที่มียีน RNA3 ของไวรัสใบด่างแตงกวา เมื่อตัดพลาสมิด pGEM-GFP และ qMCSdelQAN ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ EcoRI และ PstI จะได้ยีนผลิตโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ซึ่งมีขนาดประมาณ 750 คู่เบส และพลาสมิด qMCSdelQAN ที่เป็นเส้นตรง หลังจากนั้นเชื่อมกันด้วยเอนไซม์ T4 DNA Ligase แล้วถ่ายโอนพลาสมิดเข้าสู่ Esherichia coli DH5? พบว่าสามารถเจริญได้บนอาหารแข็งที่มีสารปฏิชีวนะกานามัยซิน และเมื่อคัดเลือกโคโลนีเดี่ยวที่เกิดขึ้นไปเพาะเลี้ยงต่อในอาหารเหลวที่มีสารปฏิชีวนะกานามัยซิน พบว่าสามารถเจริญได้อีก จากนั้นสกัดพลาสมิด และนำมาตัดอีกครั้งด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ EcoRI และ PstI เมื่อตรวจสอบด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซีสพบแถบของดีเอ็นเอนสองแถบซึ่งตรงกับขนาดของพลาสมิดqMCSdelQAN และยีน GFP หลังจากนั้นทำปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสโดยใช้ไพร์เมอร์คู่ที่จำเพาะกับยีนผลิตโปรตีนเรืองแสงสีเขียว และตรวจสอบด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซีส พบแถบของยีนผลิตโปรตีนเรืองแสงสีเขียวปรากฏขึ้นที่ตำแหน่งเดียวกัน กับยีนผลิตโปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่ใช้เป็นชุดควบคุมทางบวก เมื่อถ่ายโอนเชื้อ A. tumefaciensลูกผสมที่มีพลาสมิด pMCSdelQAN-GFP ร่วมกับ การถ่ายโอนเชื้อ A. tumefaciens ลูกผสมที่มีพลาสมิด pCB301-R1R2 เข้าสู่ใบยาสูบ พบว่า ใบยาสูบที่ได้รับการถ่ายโอนยีนด้วย A. tumefaciens ลูกผสม 2 ชนิดที่มีพลาสมิด pCB301-R1R2 และมีพลาสมิด pMCSdelQAN-GFP มีการแสดงออกของโปรตีนลูกผสม GFP ในตำแหน่งที่ได้รับการถ่ายโอนยีนในวันที่ 2 และ 4 หลังการถ่ายโอนยีน ดังนั้นงานวิจัยนี้สามารถสร้างเวกเตอร์ไวรัสพืชระบบ bipartite ที่สามารถใช้ในการผลิตโปรตีนลูกผสม GFP ในใบยาสูบได้สำเร็จ แต่ยังไม่สามารถสร้างเวกเตอร์ไวรัสพืชระบบ monopartite ได้