การศึกษาเอนไซม์ PLP synthase ในเชื้อชอบร้อน เพื่อใช้ประโยชน์ในการผลิตวิตามินบีหกทางเทคโนโลยีชีวภาพ
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
Pyridoxal 5?-phosphate (PLP) เป็นรูปหนึ่งของวิตามินบีหก เป็นโคเอนไซม์ที่สำคัญ ใน เมตาบอลิสม ของโปรตีน, คาร์โบไฮเดรท และลิพิด ทั้งยังสำคัญต่อระบบประสาท การทำงานของฮอร์โมน และการสังเคราะห์ฮีม อีกด้วย การสังเคราะห์วิตามินบีหก ใน (DXP)-independent de novo pathway พบว่า มียีน pdxS และ pdxT มาเกี่ยวข้อง เมื่อมีการแสดงออกของยีนแล้ว จะให้โปรตีน PDXS และ PDXT ซึ่งเมื่อรวมเป็นสารประกอบเชิงซ้อนแล้วจะให้เป็นเอนไซม์ pyridoxal 5?-phosphate synthase (PLP synthase) โดยที่ PDXT จะเร่งให้เกิดการเปลี่ยน glutamine เป็น ammonia จากนั้น PDXS จะเร่งให้เกิดการรวมตัวกันของ ribulose 5-phosphate (หรือ ribose 5-phosphate), glyceraldehyde-3-phosphate และ ammonia ได้วิตามินบีหก ในรูปของ PLP ในงานวิจัยครั้งนี้ ทำการโคลนและแสดงออกของ DNA ที่แปลรหัสเป็นเอนไซม์ PLP synthase จากเชื้อ Geobacillus sp. H6a (Gh) จากน้ำพุร้อนทางภาคเหนือของประเทศไทย ด้วยเทคนิค touchdown PCR PLP synthase ประกอบด้วย สองโปรตีน คือ โปรตีน PDXS และ PDXT จากยีน GhpdxS และ GhpdxT ตามลำดับ GhpdxS มีขนาด 885 base pairs แปลรหัสเป็นโปรตีนขนาด 294 amino acids ส่วน GhpdxT มีขนาด 591 base pairs แปลรหัสเป็นโปรตีนขนาด 196 amino acids ทำการแทรกยีน GhpdxS และ GhpdxT สู่พลาสมิด pET28a(+) ที่ตำแหน่งการตัดจำเพาะของ Nhe I และ BamH I แล้วย้ายเข้าสู่ E.coli BL21(DE3) จากนั้นตรวจสอบโคลนที่มียีนทั้งสองโดยวิธี digestion และ colony PCR ได้จำนวน 8 GhpdxS transformants และจำนวน 15 GhpdxT transformants จึงนำ transformant ที่ 1 ของยีนทั้งสอง มาทำการเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกด้วย 1 mM IPTG ที่อุณหภูมิ 37?C ในเวลา 0, 1, 3 และ 6 ชั่วโมง วิเคราะห์โปรตีนด้วยเทคนิค SDS-PAGE พบว่าโปรตีน PDXS และ PDXT เป็นโปรตีนหลอมรวมกับ His-tag และ thrombin cleavage site และเป็นโปรตีนที่ละลายในส่วนของ cytoplasm มีขนาดเท่ากับ 32 kDa และ 21 kDa ตามลำดับ