การสร้างและสังเคราะห์เปปไทด์ protegrin-1 ในรูป monomer และ dimer ในเซลล์แบคทีเรีย Escherichia coli และการประยุกต์ใช้: การทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียดื้อยาในหลอดทดลองและการทดสอบในสัตว์ที่ติดเชื้อ
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
เปปไทด์ต้านเชื้อจุลชีพได้รับการพิจารณาให้เป็นเหมือนยาปฏิชีวนะเพื่อใช้ในการรักษาโรคติดเชื้อในอนาคต ระบบการแสดงออกโปรตีนลูกผสมในเซลล์โปรคาริโอตเป็นเทคนิคที่ได้รับความสนใจเนื่องจากสามารถผลิตโปรตีนได้ในปริมาณมากร่วมกับสามารถทำให้บริสุทธิ์ได้อย่างมีปะสิทธิภาพ อย่างไรก็ตามระบบนี้ไม่เหมาะสมหากนำมาใช้เพื่อผลิตเปปไทด์ต้านจุลชีพ อันเนื่องมาจากฤทธิ์ที่สามารถทำลายเซลล์เจ้าบ้านได้ ดังนั้นเปปไทด์ต้านจุลชีพจึงมักถูกแสดงออกในรูปของโปรตีนผสม ซึ่งมีส่วนสำคัญในการลบล้างฤทธิ์ของเปปไทด์ และช่วยในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ นอกจากนี้ยังพบว่าการสังเคราะห์เปปไทด์ลูกผสมสามารถปรับปรุงฤทธิ์ในการฆ่าเชื้อจุลชีพด้วย ดังนั้นเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการฆ่าเชื้อ ในการศึกษาครั้งนี้ Protegrin-1 ในรูปของ dimer และ LL-37-linker-Histatin-5 ลูกผสมจึงถูกสร้างขึ้นและเชื่อมต่อกับโปรตีน biotin carboxyl carrier protein (BCCP) โปรตีนผสมถูกออกแบบให้มีตำแหน่งที่ถูกตัดด้วย hydroxylamine hydrochloride และเอนไซม์ thrombin เพื่อใช้แยกเปปไทด์จากโปรตีนเชื่อมต่อ ยีน AMPs ถูกเชื่อมต่อทางด้าน C-terminus ของยีน BCCP โดยอาศัยเทคนิค SOE-PCR และถูกโคลนไปยังเวคเตอร์ pET-28a และให้มีการแสดงออกใน E. coli สายพันธุ์ BL21(DE3)pLysS หลังจาการกระตุ้นด้วยสาร IPTG มีการแสดงออกของโปรตีนประมาณ 20% ในรูปของ Inclusion bodies ซึ่งโปรตีนมีขนาดประมาณ 24.5 กิโลดาลตัน สอดคล้องกับขนาดที่คาดหวังไว้ โปรตีน BCCP-AMPs ที่ผ่านการทำบริสุทธิ์มีปริมาณ 1.5 มิลลิกรัมต่อแบคทีเรีย 1 ลิตร และมีความบริสุทธิ์ถึง 76% ผลจากการย้อมฟลูออเรสเซนต์ยังแสดงให้เห็นว่าโปรตีน BCCP สามารถจับกับ streptavidin ซึ่งสามารถใช้ประโยชน์ในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ได้อีกวิธีหนึ่ง นอกจากนี้จากการทดสอบฤทธิ์ของเปปไทด์ด้วยวิธี radial diffusion assay แสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ลูกผสมมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียสายพันธุ์มาตรฐาน E. coli และ S. aureus เมื่อเปรียบเทียบฤทธิ์ในการฆ่าเชื้อจุลชีพของเปปไทด์ protegrin-1 ชนิด monomer และ dimer โดยวิธี Time-killing assay ซึ่งผลการวิจัยพบว่าเปปไทด์ชนิด monomer มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเชื้อได้ดีกว่าชนิด dimer โดยสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได้ภายใน 30 นาที และเมื่อผสมเปปไทด์แต่ละชนิดกับสารก่อเจลเพื่อทำเป็นพลาสเตอร์แล้วทำประเมินประสิทธิภาพกับอาสาสมัครจำนวน 10 ราย โดยปิดพลาสเตอร์บริเวณผิวหนังใต้ท้องแขนเป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่าพลาสเตอร์ที่ผสมเปปไทด์ทั้งสองชนิดสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อที่ผิวหนังได้ดีเมื่อเปรียบเทียบกับเชื้อที่ผิวหนังและพลาสเตอร์ควบคุม เปปไทด์ผสมพลาสเตอร์ไฮโดรเจลที่พัฒนาขึ้นในครั้งนี้อาจนำไปใช้เพื่อรักษาโรคแผลติดเชื้อทั่วไปและสามารถนำไปใช้เพื่อป้องกันการติดเชื้อในผู้ป่วยที่ได้รับการผ่าตัดได้ต่อไป