การพัฒนาสารบริสุทธิ์จากสะบันงาป่าในการทำให้เซลล์มะเร็งเต้านมตายแบบอะพอพโทซิส

บทคัดย่อ

องค์ประกอบสำคัญที่มีฤทธิ์ทำงชีวภำพในใบและกิ่งของต้นสะบันงำป่ำ (Goniothalamus griffithii Hook. f. et Thomson) ได้แก่ สำรพิโนเซมบริน (Pinocembrin, PCN) และ โกนิโอทำลำมิน (Goniothalamin, GTN) วัตถุประสงค์ของกำรศึกษำนี้ เพื่อตรวจหำฤทธิ์ต้ำนมะเร็งของสำรพิโนเซมบริน และโกนิโอทำลำมิน รวมทั้งกลไกกำรสื่อสัญญำณของกระบวนกำรตำยในเซลล์มะเร็งมนุษย์เปรียบเทียบกับเซลล์ปกติ NIH3T3 (เซลล์สร้ำงเส้นใยของหนู) เมื่อทำกำรทดสอบเซลล์มะเร็งชนิดต่ำงๆ หำควำมเป็นพิษขององค์ประกอบหลักในพืชสะบันงำป่ำ โดยใช้วิธี MTT ชนิดของกระบวนกำรตำยของเซลล์ยืนยันโดยกำรย้อมด้วย แอนเน็กซิน ไฟว์ ฟลูโอเรสซีน ไอโซไธโอไซยำเนต และโพรพิเดียม ไอโอไดด์ โดยใช้เทคนิคโฟล ไซโตเมทรี นอกจำกนี้ ยังย้อมเซลล์ MDA-MB-231 ด้วยโพรพิเดียม ไอโอไดด์ แล้วดูรูปร่ำงของเซลล์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูโอเรสเซนส์ นับจำนวนเซลล์ที่ตำยโดยกระบวนกำรตำยแบบอะพอพโทซิส ที่มีรูปร่ำงของนิวเคลียสหดแน่น และกำรแตกหักของเซลล์กลำยเป็น อะพอพโทติค บอดี้ กำรลดลงของศักย์ไฟฟ้ำที่เยื่อหุ้มชั้นนอกของไมโทคอนเดรีย โดยบ่มกับสีฟลูโอโรโครม ไดเฮ็กซิลโลซำคำร์โอไซยำไนน์ ไอโอไดด์ (DiOC6) ทำกำรตรวจวัดโดยเครื่องมือโฟลไซโตมิเตอร์ กำรตรวจวัดกัมมันตภำพของเอนไซม์คำสเพส 3, -8 และ 9 โดยกำรใช้ซับสเตรตที่ติดฉลำกกับสำรเรืองแสง เมื่อเอนไซม์คำสเพสชนิดต่ำงๆ ทำงำน เอนไซม์จะตัดสำร พำรำ-ไนโตรอะนีลีน ออกจำกซับสเตรตตำมชนิดของแต่ละคำสเพส ทำให้ พำรำ ไนโตรอะนีลีนดูดกลืนแสง วัดโดยอำศัยเครื่องสเปคโตรโฟโตมิเตอร์ กำรสร้ำงสำรอนุมูลอิสระ (reactive oxygen species, ROS) สำมำรถวัดโดยใช้สำรเรืองแสง 2’,7’-dichlorohydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) นอกจำกนี้ ทำกำรวัดระดับของโปรตีนและเอ็มอำร์เอ็นเอที่แสดงออกในโปรตีนหรือยีนตระกูล Bcl-2 โดยวิธี immunoblotting และ real-time reverse-transcriptase (RT) polymerase chain reaction (PCR) ตำมลำดับ กำรดำเนินไปของวัฎจักรเซลล์วัดกำรย้อมนิวเคลียสของเซลล์ด้วยสำรเรือง PI ร่วมกับกำรวัด phosphor-ATM ด้วยเครื่อง Guava สุดท้ำย ศึกษำผลของกำรใช้ยำเคมีบำบัด 5 ชนิด ร่วมกับสำรโกนิโอทำลำมิน ว่ำมีฤทธิ์เสริมกัน (additive หรือ synergistic) หรือต้ำนกันอย่ำงไร (antagonistic) โดยใช้โปรแกรม Compusyn software สำร GTN มีควำมเป็นพิษต่อเซลล์ MCF-7 > HeLa > MDA-MB231 > HepG2 > NIH3T3 โดยมีค่ำที่ยับยั้งกำรเจริญเติบโต 50% ในแต่ละชนิดเซลล์เพำะเลี้ยงเป็นดังนี้ IC50 values of 7.33, 14.77, 37.14, 44.58 และ 65.36 ?M ตำมลำดับ ขณะที่ PCN มีควำมเป็นพิษต่อเซลล์มะเร็งตับชนิด HepG2 โดยมีค่ำ IC50 เท่ำกับ ~80 ?M ส่วนชนิดของกระบวนกำรตำยของเซลล์ พิสูจน์โดยกำรวัดกำรติดสีของแอนเน็กซิน ไฟว์ ที่ติดฉลำกด้วย FITC เป็นกระบวนกำรตำยของเซลล์แบบอะพอพโทซิสในระยะแรก (early apoptosis) แบบเพิ่มขึ้นตำมควำมเข้มข้นของสำร GTN ที่สูงขึ้น แสดงว่ำ มีกำรเคลื่อนย้ำยของฟอสฟำติดิลซีรีนจำกชั้นในไปยังชั้นนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ นอกจำกนี้ เปอร์เซ็นต์เซลล์ที่ย้อมติดสี PI มีลักษณะนิวเคลียสหดแน่น และกำรแตกหักของเซลล์ เมื่อทำกำรนับภำยใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูโอเรส iv เซนส์ พบกำรเพิ่มขึ้นของอะพอพโทติคเซลล์ตำมควำมเข้มข้นของสำร GTN เช่นกัน แล้วคำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ จำกเซลล์ทั้งหมด 200 เซลล์ ทำซ้ำ 2 ครั้ง แยกกัน พบกำรลดลงของศักย์ไฟฟ้ำที่เยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียในเซลล์ดังต่อไปนี้คือ MCF-7, HepG2 และ HeLa cells เมื่อบ่มกับโกนิโอทำลำมิน ในกำรกระตุ้นเซลล์ MCF-7 และ MDA-MB-231 ด้วย GTN จะเพิ่มกัมมันตภำพของทั้งเอนไซม์คำสเพส-3, -8 และ -9 ดังนี้ ในเซลล์ HeLa cells เพิ่มกัมมันตภำพของเอนไซม์ คำสเพส-3 และ -9 แต่ในเซลล์ MCF-7 และ HepG2 มีกัมมันตภำพของคำสเพส--8 ที่เพิ่มเท่ำนั้น ทั้งสองเซลล์เมื่อบ่มกับ GTN และ PCN9 ตำมลำดับ โดยสรุป สำรโกนิโอทำลำมินและพิโนเซมบริน สำมำรถเหนี่ยวนำเซลล์มะเร็งเพำะเลี้ยงให้ตำยโดยกระบวนกำรตำยแบบอะพอพโทซิสโดยผ่ำนทำงโมเลกุล หรือสำรตัวกลำงต่ำงๆ ซึ่งอำจจะเนื่องจำกกลไกต่ำงกัน หรือ ควำมแตกต่ำงของชนิดของเซลล์มะเร็ง และสำรองค์ประกอบทั้งสองเองที่สำมำรถเปลี่ยนแปลงวิถีได้ทั้งวิถีกำรตำยแบบอะพอพโทซิส ทั้งวิถีภำยในและวิถีภำยนอก เลือกเฉพำะเซลล์ MDA-MB-231 เพื่อศึกษำกลในระดับโมเลกุลในรำยละเอียด เนื่องจำกเซลล์ชนิดนี้เป็นเซลล์มะเร็งเต้ำนมชนิดรุกรำน และดื้อต่อยำเคมีบำบัดเนื่องจำกเซลล์ไม่มีโปรตีนตัวรับ 3 ชนิด (triple negative receptors) ได้แก่ estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) และ epidermal growth factor receptor (EGFR) หรืออีกชื่อคือ neu/HER2 กัมมันตภำพของเอนไซม์คำส--3, -8 and -9 เพิ่มสูงขึ้นเมื่อบ่มกับสำรโกนิโอทำลำมินเพิ่มขึ้นตำมควำมเข้มข้น และกำรสร้ำงสำรอนุมูลอิสระออกซิเจน (reactive oxygen species, ROS) เพิ่มสูงขึ้นในเซลล์มะเร็งเต้ำนม MDA-MB-231 ซึ่งเหนี่ยวนำโดย GTN เมื่อบ่มเซลล์มะเร็งเต้ำนม MDA-MB-231 ที่บังคับให้เซลล์อยู่ในสภำพลอย สำรโกนิโอทำลำมินเหนี่ยวนำเซลล์มะเร็งเต้ำนมให้ตำยโดยกระบวนกำรตำยแบบอะนอยคิส โดยมีค่ำ IC50 ~60 ?M สำร GTN เปลี่ยนแปลงกำรแสดงออกของโปรตีนที่สัมพันธ์กับกระบวนกำรตำยแบบอะพอพโทซิสตรวจโดย โดย Western blot ได้แก่ โปรตีน Bax, Bim, Bad, dephospho-Bad112, Bcl-2, Bcl-xL และ Smac ยีน smac และ bad มีกำรแสดงออกในระดับเอ็มอำร์เอมำกกว่ำกลุ่มควบคุม (ไม่ได้ให้สำร GTN) สำรโกนิโอทำลำมินยังสำมำรถเหนี่ยวนำให้เซลล์หยุดที่วัฏจักรเซลล์ที่เฟส G2/M และเพิ่มระดับของโปรตีน ฟอสโฟ--เอทีเอ็ม (phosphor-ATM) ตรวจวัดโดยเครื่อง Guava ระดับของแคลเซียมในไซโทพลำซึมเพิ่มขึ้นและระดับแคลเซียมไอออนลดลงในไมโทคอนเดรีย นอกจำกนี้ สำรองค์ประกอบ GTN เสริมฤทธิ์แบบซินเนอจิสติคกับยำเคมีบำบัด 4 ชนิด ได้แก่ ไซโคลฟอสฟำไมด์ 5--ฟลูโอโรยูเรซิล แพคลิแท็กเซล และวินบลำสติน และมีฤทธิ์เสริมแบบ แอดดิทีฟ กับยำเคมีบำบัดเมโธเทร็กเซต โดยใช้วิธี MTT ดังนั้น สำรโกนิโอทำลำมินเหนี่ยวนำเซลล์มะเร็งเต้ำนมมนุษย์ MDA-MB-231 ให้ตำยโดยกระบวนกำรตำยแบบอะพอพโทซิสผ่ำนทำงวิถีภำยใน วิถีภำยนอก ภำวะเครียดร่ำงแหเอนโดพลำซึม และภำวะเครียดออกซิเดชัน โดยผ่ำนทำงโมเลกุลต่ำงๆในกลไก โมเลกุลที่สื่อสัญญำณในวิถีอำจจะใช้เป็นยุทธวิธีในเป้ำหมำยใหม่ สำหรับกำรรักษำมะเร็ง สำรโกนิโอทำลำมินเองอำจจะถูกพัฒนำไปเพื่อใช้รักษำโรคมะเร็ง

คำสำคัญ