การพัฒนาชุดตรวจด้วยดีเอ็นเอเซ็นเซอร์สำหรับโรคพีอาร์อาร์เอสและโรคเซอร์โคไวรัสในสุกร ปีที่ 2

บทคัดย่อ

ปัญหาการติดเชื้อไวรัสอาร์อาร์เอส (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)และเชื้อไวรัสเซอร์โค (Porcine circovirus type 2, PCV2) สามารถพบได้เป็นประจำในระหว่างการเลี้ยงสุกร บ่อยครั้งที่พบการติดเชื้อร่วมกันของเชื้อไวรัสทั้งสองชนิดนี้พร้อมกันภายในฟาร์ม และ/หรือบางครั้งอาจพบการติดเชื้อไวรัส PRRSV มากกว่าหนึ่งสายพันธุ์ ซึ่งการติดเชื้อในลักษณะนี้ ทำให้เกิดปัญหาอย่างมากในการควบคุมป้องกันและรักษาโรคและทำให้เกิดความเสียหายอย่างมาก ในการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อไวรัสนั้น สามารถดำเนินการได้หลายวิธี เช่น การตรวจสอบรอยโรคที่เห็นด้วยตาเปล่าจากการผ่าซากสุกรที่ตาย หรือการศึกษารอยโรคในเนื้อเยื่อด้วยการตรวจทางอิมมูโนฮีสโตเคมีสทรี (Immuno-histochemistry) หรือการตรวจหารสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัสในเซลล์ของเนื้อเยื่อด้วยวิธีอินไซตูไฮบริดไดเซชั่น (In situ hybridization) หรือการเจาะเลือดจากสุกรที่ตายหรือยังมีชีวิต เพื่อทำการตรวจหาเชื้อด้วยวิธีการพีซีอาร์ (polymerase chain reaction, PCR) เป็นต้น ซึ่งวิธีการตรวจเหล่านี้ มีข้อจำกัดในเรื่องความซับซ้อนในการตรวจ ระยะเวลา ความต้องการทักษะความชำนาญ และต้องพึ่งพาห้องปฏิบัติการอยู่มาก ซึ่งข้อจำกัดของวิธีการตรวจเหล่านี้เป็นอุปสรรคในการขยายผลไปสู่การใช้งานในการจัดการและควบคุมการเกิดโรคได้จริงในภาคสนาม และจากการศึกษาวิจัยและพัฒนาในปี พ.ศ. 2561 ทางคณะผู้วิจัยได้พัฒนาชุดตรวจต้นแบบดีเอ็นเอเซ็นเซอร์ (DNA sensor) สำหรับการตรวจวินิจฉัยโรค PRRSV ร่วมกับโรค PCV2 ในสุกร และของชุดตรวจ DNA sensor สำหรับการตรวจเชื้อไวรัส PRRSV ทั้ง 3 สายพันธุ์ ได้แก่ สายพันธุ์อเมริกา (North America strain, US) ยุโรป (European strain, EU) และสายพันธุ์รุนแรง (Highly pathogenic strain, HP) สำหรับใช้ในภาคสนามได้ ดังนั้นวัตถุประสงค์ของการศึกษาในครั้งนี้ คือ 1. เพื่อทำการทดสอบประสิทธิภาพของการใช้งาน (validate) ของชุดตรวจต้นแบบ DNA sensor สำหรับการตรวจวินิจฉัยโรค PRRSV ร่วมกับโรค PCV2 ในสุกร และชุดตรวจ DNA sensor สำหรับการตรวจเชื้อไวรัส PRRSV ทั้ง 3 สายพันธุ์ และ 2. เพื่อพัฒนาเทคนิคในการตรวจเชื้อไวรัส PRRSV และ PCV2 บนพื้นฐานปฏิกิริยาการเพิ่มปริมาณสัญญาณดีเอ็นเอร่วมรีคอมบิเนสพอลิเมอร์เลส (Recombinase Polymerase Amplification, RPA) ผลการศึกษาการใช้งานชุดตรวจ DNA sensor สำหรับการตรวจเชื้อไวรัส PRRSV ร่วมกับโรค PCV2 ในภาคสนาม พบว่าสามารถตรวจวิเคราะห์การติดเชื้อไวรัสทั้งสองชนิดได้อย่างมีประสิทธิภาพ จากตัวอย่างเลือด (serum) และตัวอย่างชิ้นเนื้อจำนวน 412 ตัวอย่าง โดยให้ความจำเพาะ (specificity) สูงถึง 93.69% ด้วยความไวของปฏิกิริยา (sensitivity) 98.75% และผลการทดสอบชุดตรวจดีเอ็นเอเซ็นเซอร์สำหรับตรวจเชื้อไวรัส PRRSV 3 สายพันธุ์ ในภาคสนาม พบว่าสามารถตรวจวิเคราะห์การติดเชื้อไวรัสทั้ง 3 สายพันธุ์ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยให้ความจำเพาะสูงถึง 99.63% ด้วยความไวของปฏิกิริยา 94.62% จากจำนวนตัวอย่างที่ 310 ตัวอย่าง ที่ทำการทดสอบทั้งหมด และจากการศึกษา พบว่าสามารถพัฒนาวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมด้วยเทคนิค RPA เพื่อใช้เป็นทางเลือกในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมที่ใช้อุณหภูมิระนาบเดี่ยวได้ ซึ่งเทคนิค RPA ที่พัฒนานั้น ใช้อุณหภูมิระนาบเดี่ยวในการทำปฏิกิริยาที่ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับวิธีการ LAMP โดยที่เทคนิค RPA สามารถเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของไวรัสในระดับจำกัด (Limit of detection) ได้ที่ 100 ก็อปปี้ (copies) มีความจำเพาะต่อไวรัสเป้าหมาย คือ เชื้อไวรัส PRRSV และ PCV2 และการตรวจเชื้อไวรัส PRRSV ระหว่างสายพันธุ์ PRRSV-EU และ PRRSV-US ได้ และสามารถแยกความแตกต่างของการทดสอบจากเชื้อไวรัสชนิดอื่น เช่น Porcine parvovirus, Classical Swine Fever virus และ Influenza A virus เป็นต้น ชุดตรวจ DNA sensor สำหรับการตรวจเชื้อไวรัส PRRSV ร่วมกับโรค PCV2 ด้วยเทคนิค RPA สามารถตรวจวิเคราะห์เชื้อไวรัส PRRSV และ PCV2 ทั้งสองชนิดได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยให้ความจำเพาะสูงถึง 90.9 % ด้วยความไวของปฏิกิริยา 97.56% และให้ความสามารถในการทำซ้ำที่ 97.56% และชุดตรวจ DNA sensor สำหรับการตรวจเชื้อไวรัสระหว่าง PRRSV-EU และ PRRSV-US ด้วยเทคนิค RPA สามารถตรวจวิเคราะห์ชนิดของเชื้อไวรัสได้ โดยให้ความจำเพาะสูงถึง 81.81 % ด้วยความไวของปฏิกิริยา 100% และให้ความสามารถในการทำซ้ำที่ 96.38% ดังนั้นจากผลการศึกษาในครั้งนี้ สามารถที่จะประยุกต์ใช้เทคนิค RPA ในการเพิ่มทางเลือกในการใช้งานชุดตรวจดีเอ็นเอเซ็นเซอร์ได้อีกวิธีหนึ่งในภายหน้า

คำสำคัญ