การศึกษาความจำเพาะของเอนไซม์ปาเปนจากยางมะละกอ เพื่อประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรม

บทคัดย่อ

งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อศึกษาบริเวณเร่งปฏิกิริยาที่ตำแหน่ง S1-subsite ของเอนไซม์ ปาเปนบริสุทธิ์ด้วยสับสเตรทสังเคราะห์ที่เป็นอนุพันธ์ของพารา-ไนโตรอะนิไลด์ โดยทำการแยกน้ำยางจากผลดิบมะละกอสายพันธุ์แขกดำ พร้อมทำการยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์ด้วยสารละลาย 2,2?-dipyridyl disulphide (2PDS) อิ่มตัว เมื่อทำการแยกเอนไซม์ปาเปนให้บริสุทธิ์ด้วยเครื่อง Fast protein liquid chromatography (FPLC) โดยใช้คอลัมน์ HiLoad 26/10 SP-Sepharose HP และนำไปตรวจสอบความบริสุทธิ์และหาขนาดมวลโมเลกุลด้วยเทคนิค SDS-PAGE พบว่าปาเปนบริสุทธิ์มีขนาดมวลโมเลกุลประมาณ 29 กิโลดาลตัน จากนั้นทำการสังเคราะห์สับสเตรทที่เป็นอนุพันธ์ของพารา-ไนโตรอะนิไลด์ ได้แก่ N-Ac-L-Phe-Gly-pNA, N-Ac-L-Phe-Leu-pNA, N-Ac-L-Phe-Arg-pNA, N-Ac-L-Phe-Phe-pNA และ N-Ac-L-Phe-Glu-pNA จากการตรวจสอบความบริสุทธิ์ด้วย thin-layer chromatography, optical rotation, nuclear magnetic resonance, mass spectroscopy และ elemental analysis พบว่าสับสเตรทที่สังเคราะห์ขึ้นมีความบริสุทธิ์สูง เมื่อเปรียบเทียบความจำเพาะบริเวณ S1-subsite ของปาเปนบริสุทธิ์โดยวิธีทางจลศาสตร์ พบว่า kcat/Km ของ N-Ac-L-Phe-Gly-pNA, N-Ac-L-Phe-Leu-pNA, N-Ac-L-Phe-Arg-pNA และ N-Ac-L-Phe-Phe-pNA มีค่าเท่ากับ 269.77, 1367.00, 1469.37 และ 473.49 M-1.S-1ตามลำดับ ส่วน N-Ac-L-Phe-Glu-pNA ไม่สามารถนำมาเปรียบเทียบได้ อย่างไรก็ตามเมื่อทำการตรวจสอบแอคติวิตีกับเอนไซม์ปาเปนบริสุทธิ์ที่ความเข้มข้นอิ่มตัว พบว่ามีแอคติวิตีเท่ากับ 0.05 dA410/min แสดงให้เห็นว่าบริเวณ S1-subsite ของ active site ของเอนไซน์ปาเปนบริสุทธิ์มีคุณสมบัติค่อนข้าง broad specificity

คำสำคัญ