การพัตนาชุดตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีนนิวคลีโอฟอสมินในผู้ป่วยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดมัยอีลอยด์เพื่อการรักษาอย่างแม่นยำ

บทคัดย่อ

บทนำ: การกลายพันธุ์ของยีนนิวคลีโอฟอสมิน (nucleophosmin; NPM1) เป็นการเปลี่ยนแปลงในระดับโมเลกุลที่พบมากที่สุดในโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดมัยอีลอยด์ (AML) โดยเฉพาะในผู้ป่วยที่มีจำนวนและลักษณะโครโมโซมปกติ การกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ยังเป็นตัวบ่งชี้ที่ดีสาหรับการพยากรณ์โรค AML การศึกษานี้ได้พัฒนาชุดน้ำยาที่สามารถตรวจการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ภายในปฏิกิริยาเดียวถึง 4 ชนิด (type A, B, D และ J) ด้วยเทคนิค E-ice-COLD-PCR ร่วมกับเทคนิค HRM วิธีการทดลอง: เทคนิค E-ice-COLD-PCR จะอาศัย blocker probe ที่จับได้จำเพาะกับ wild-type แต่จับกับ mutant แบบไม่จำเพาะ และที่อุณหภูมิ critical temperature (Tc) จะเพิ่มจำนวนได้เฉพาะ mutant โดยจะใช้ DNA template ความเข้มข้น 5 นาโนกรัม ในน้ำยาที่มีส่วนผสม 2x NPM1 HRM master mix ความเข้มข้นสุดท้าย 1x, NPM-LNA Probe ความเข้มข้นสุดท้าย 400 นาโนโมลาร์ ปรับปริมาตรสุดท้ายให้ครบ 25 ไมโครลิตรด้วยน้ำกลั่น ทำปฏิกิริยา ด้วยเครื่อง Realtime-PCR หรือ PCR machine การศึกษานี้ใช้ตัวอย่างเลือดจากผู้ป่วยโรค AMLจำนวน 83 ตัวอย่าง จากโรงพยาบาลมหาราชนครเชียงใหม่ ทำการเปรียบเทียบผลการตรวจด้วยชุดน้ำยา NPM1 HRM master mix ด้วยเทคนิค E-ice-COLD-PCR กับวิธี standard PCR และวิธี direct sequencing ผลการทดลอง: ชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix ให้ผลความไวและความจำเพาะเทียบเท่ากับวิธี direct sequencing โดยพบการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ในผู้ป่วย 9 ราย จากทั้งหมด 83 ราย เมื่อทำการตรวจยืนยัน ด้วยวิธี direct sequencing โดยใช้ PCR product จากวิธี E-ice-COLD-PCR พบว่าผลในตัวอย่างทั้ง 9 ราย สอดคล้องกับวิธี E-ice-COLD-PCR รวมทั้งแปลผลได้ง่าย โดยให้ผลเป็น type A แต่เมื่อใช้ PCR product จากวิธี standard PCR ให้ผลบวกในผู้ป่วย เพียง 8 ราย เนื่องจากในตัวอย่างมีสัดส่วนของการกลายพันธุ์ของยีนต่ำ ทำให้ PCR product ของยีนที่มีการกลายพันธุ์ถูกบดบังด้วย wild-type และรบกวนการอ่านผลของวิธี direct sequencing ดังนั้นการทำ E-ice-COLD-PCR ก่อนยืนยันผลด้วยวิธี direct sequencing จึงสามารถเพิ่มความไวของวิธี direct sequencing ได้ สรุปผลการทดลอง: การเปรียบเทียบวิธี standard PCR และวิธี direct sequencing กับชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix สรุปได้ว่าเทคนิคการตรวจและชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix สามารถตรวจการกลายพันธุ์ได้ครอบคลุมทั้ง 4 ชนิด ภายในปฏิกิริยาเดียว โดยใช้กับทั้งเครื่อง real-time PCR และ conventional PCR ได้ และสามารถตรวจการกลายพันธุ์ในกรณีที่มี background ของ wild-type สูงและให้ผลที่น่าเชื่อถือ สามารถนำไปใช้ตรวจตรวจหาการกลายพันธุ์ NPM1 ได้ในโรงพยาบาลที่มีการวินิจฉัยและรักษาผู้ป่วย AML ซึ่งไม่ต้องอาศัยเครื่องมือที่มีราคาแพง และผู้ชำนาญการในการทำหรือแปลผล

คำสำคัญ