การศึกษาความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งในเขตภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนล่างโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ

บทคัดย่อ

วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุล ม้าวิ่งต้นโตยใช้เครื่องหมายโมเลกุลดีเอ็นเอ เชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้ที่นำมาศึกษาได้มาจากแหล่ง กระจายพันธุ์ใน 5 จังหวัด ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยได้แก่ อุบลราชธานี ร้อยเอ็ด มุกดาหาร เลย และศรีสะเกษ รวม จำนวน 69 สายต้น จากการเปรียบเทียบวิธีการสกัดดีเอ็นเอ 4 วิธี พบว่า วิธีการสกัดดีเอ็นเอที่เหมาะสมในการสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่ง คือ วิธี 29 CTAB with phenol-chloroform ของ Sue et al. (1997 โดยดีเอ็นเอที่สกัดได้มีปริมาณมาก เฉลี่ย 5-10 ไมโครกรัม และ คุณภาพดี โดยมีลักษณะใสไม่มีสี และวิธีนี้มีการปนเปื้อนของโพลีแชค คาไรด์ และสารประกอบฟิโนลิก น้อย เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีอื่น การประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจำนวน 50 สายต้น โดยเทคนิคอาร์เอพีดี เริ่มจากการศึกษระดับความเข้มข้นขององค์ประกอบสารละลายในปฏิกิริยา อาร์เอพีดีที่เหมาะสม กำหนดตัวแปรขององค์ประกอบสารละลายที่จะศึกษา 3 ตัวแปรได้แก่ ความ เข้มข้นของดีเอ็นเอ 2 ระดับ ได้แก่ 10 และ20 นาโนกรัม ความเข้มข้นของแมกนีเซียมคลอไรด์ 3 ระดับ ไต้แก่ 2, 2.5 and 3.0 มิลลิโมลาร์ ความเข้มข้น Tag DNA polymerase 2 ระดับ ได้แก่ 0.5 และ 1 ยูนิต และ กำหนดความเข้มข้นของ dNTPs และไพรเมอร์ OPA01 คงที่ คือ 200 และ 0.6 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโตยใช้ PCR profile ดังนี้ 94 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที ตามต้วยโปรแกรมการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ 40 รอบ ที่ Denaturation 94 องศาเซลเซียส นาน 1 นาที Annealing 36 องศาเซลเชียส นาน 1 นาที และ Extension 72 องศาเซลเชียส นาน 2 นาที ตามด้วย Long Extension ที่ 72 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที ผลการศึกษา พบว่า ระดับ ความเข้มข้นขององค์ประกอบสารละลายพีซีอาร์ของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งโดยเทคนิคอาร์เอพีดีที่ เหมาะสมในปริมาตรรวม 20 ไมครลิตรด้แก่ เอ็นต้นแบบ 10 นาโนกรัม Taq DNA polymerase 1 ยูนิต แมกนีเชียมคลอไรด์ (MeCเ ) 2.5 มิลลิโมลาร์ dNTPs 200 ไมโครโมลาร์ ไพร เมอร์อาร์เอพีดี 0.6 ไมโครโมลาร์ และ สารละลาย PCR buffer 1X จากกรคัดกรองไพรเมอร์อาร์ เอพีดี จำนวน 110 ไพรเมอร์ พบว่า มี 27 ไพรเมอร์ให้แถบดีเอ็นเอที่ชัดเจน และแสดงความ แตกต่างระหว่างสายต้น (polymorphism) เมื่อนำไพรเมอร์ดังกล่าวมาสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอของ กล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจำนวน 50 สายต้น สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้แถบดีเอ็นเอที่แสดงความ แตกต่างระหว่างพันธุ์ (เครื่องหมายอาร์เอพีดี จำนวน 204 เครื่องหมาย แต่ละไพรเมอร์ไห้ เครื่องหมายอาร์เอพีดีได้ จำนวน ตั้งแต่ 2 ถึง 15 เครื่องหมาย คิดเป็นค่าเฉลี่ยเท่ากับ 7 เครื่องหมาย ต่อไพรเมอร์ นำข้อมูลเครื่องหมายอาร์เอพีดีมาวิเคราะห์ค่าสัมประสิทธิ์ความเหมือนทางพันธุกรรม โดยวิธีของ Dice (Dices Similarity coefficient) พบว่า มีค่าตั้งแต่ 0.43 ถึง 0.98 คิดเป็นค่าเฉลี่ย เท่ากับ 0.69 เมื่อนำมาจัดกลุ่มทางพันธุกรรมโดยวิธี UPGMA (UPGMA cluster analysis) และ วิเคราะห์ปัจจัยหลัก (Principal component analysis: PCA พบว่า จัดกลุ่มทางพันธุกรรมของ กล้วยไม้สกุลม้าวิ่งได้เป็น 2 กลุ่มใหญ่ และแยกกลุ่มกล้วยไม้ม้าวิ่ง และกล้วยไม้แดงอุบลได้อย่าง ชัดเจน ค่าผลรวมที่ได้จากกรวิคราะห์ปัจจัยหลัก สามปัจจัยแรกสามารถอธิบายความผันแปร ทั้งหมดของการประเมินความเหมือนทางพันธุกรรมได้ 43.71 เปอร์เซ็นต์และ ประเมินความ เหมาะสมของการจัดกลุ่มทางพันธุกรรมจากค่า cophenetic correlation coefficient (r) พบว่า มีความน่าเชื่อถือในระดับปานกลาง ( r= 0.75) การประเมินความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจำนวน 51 สายต้น ในภาค ตะวันออกเฉียงเหนือโดยใช้เทคนิคเอเอฟแอลพี จากการคัดกรองไพรเมอร์เอเอฟแอลพี (EcoRI+3 /Msel+3) จำนวน 40 คู่ พบว่า มี 12 คู่ไพรเมอ ให้แถบลายพิมพ์ดีเอ็นเอชัดเจน ได้แถบดีเอ็นเอที่ แสดงความแตกต่างระหว่างพันธุ์ (AFLP markers) จำนวน 319 เครื่องหมาย คิดเป็นค่าเฉลี่ย 26.58 เครื่องหมายต่อคูไพรเมอร์ ค่า polymorphic information content (PIC)หรือ heterozygosity ของเครื่องหมายเอเอฟแอลพี มีค่าตั้งแต่ 0.01-0.50 โดยค่า PICร ในช่วง 0.46- 0.50 คิดเป็น 70 เปอร์เซ็นต์ของจำนวนเครื่องหมายทั้งหมด นำข้อมูลเครื่องหมายเอเอฟแอลพีมา ประเมินความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมโดยวิธีของ Dice พบว่าค่าสัมประสิทธิ์ความเหมือนทาง พันธุกรรมของเชื้อพันธุกรรมกลัวยไม้ม้าวิ่งที่ศึกษา มีค่าตั้งแต่ 0.46 ถึง 0.98 คิดเป็นค่าเฉลี่ยเท่ากับ 0.67 จากนั้นนำข้อมูลความเหมือนทงพันธุกรรมมาจัดกลุ่มโดยใช้วิธี UPGMA และการวิเคราะห์ ปัจจัยหลัก (PCA) สามารถจัดกลุ่มกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งได้เป็น 4 กลุ่ม และแยกกลุ่มกล้วยไม้ม้าวิ่ง และ กล้วยไม้แดงอุบลได้อย่างชัดเจน ผลการวิเคราะห์ปัจจัยหลัก (PCA) สามพารามิเตอร์แรก สามารถ อธิบายความผันแปรของการประเมินความเหมือนทางพันธุกรรมได้ 52.82 เปอร์เซ็นต์ การจัดกลุ่ม ทางพันธุกรรมมีความน่าเชื่อถือในระดับสูง ( r = 0.86) การเปรียบเทียบประสิทธิภาพระหว่างเทคนิคอาร์เอพีดี และเอเอฟแอลพี ในการประเมิน ความผันแปรทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่ง จำนวน 32 สายต้น พบว่า การสร้างลายพิมพ์ ดีเอ็นเอของเชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้สกุลม้าวิ่ง จากเทคนิคอาร์เอพีดี จำนวน 22 3ssays และ เทคนิค เอเอฟแอลพี จำนวน 12 assays สามารถได้ polymorphic markers จำนวน 165 และ 299 เครื่องหมาย ตามลำดับ คิดเป็นค่าเฉลี่ย 7.5 และ 26.58 เครื่องหมายต่อ assay ตามลำดับ โดย พบว่า เทคนิคเอเอฟแอลพีสามารถให้ค่า effective multiplex ratio ซึ่งหมายถึง จำนวนของ polymorphic marker ที่ได้ในหนึ่งปฏิกิริยา สูงกว่า เทคนิคอาร์เอพีดี ถึง 3.5 เท่า และเมื่อ พิจารณาคำา marker index ซึ่งเป็นผลคูณระหว่างค่ effective mutiplex ratio และค่ heterozygosity พบว่า เทคนิคเอเอฟแอลพี มีค่า marker index สูงกว่าเทคนิคอาร์เอพีดี (7.44 และ 2.55 ตามลำดับ) ถึง 2.9 เท่า เมื่อนำเครื่องหมายอาร์เอพีดี และเครื่องหมายเอเอฟแอลพี รวม จำนวน 464 เครื่องหมาย มาวิเคราะห์ค่าสัมประสิทธิ์ความเหมือนกันทางพันธุกรรมด้วยวิธีของ Dice พบว่า มีค่าตั้งแต่ 0.50 ถึง 0.96 โดยมีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 0.67 จากนั้นนำมาจัดกลุ่มพันธุกรรม โดยวิธี UPGMA พบว่า สามารถจัดกลุ่มของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งได้เป็น 2 กลุ่มใหญ่ โดยสามารถแยก กลุ่มกล้วยไม้ม้าวิ่ง และกล้วยไม้แดงอุบลได้อย่างชัดเจน การจัดกลุ่มทางพันธุกรรมมีความเหมาะสม และน่าเชื่อถือในระดับสูง ( r= 0.87) ผลการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจากแหล่งกระจาย พันธุ์ใน 5 จังหวัดในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลดีเอ็นเอ (อาร์เอพีดี และ เอเอฟแอลพี) พบว่า เชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งดังกล่าว มีความหลากหลาย ทางพันธุกรรมค่อนข้างต่ำ จากผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าเทคนิคเอเอฟแอลพี่มีความเหมาะสมใน การนำมาสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอเพื่อศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตได้อย่างมี ประสิทธิภาพ ข้อมูลความความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งนี้ จะ เป็นฐานข้อมูลสำคัญทางพันธุกรรมในการปรับปรุงพันธุ์กล้วยไม้สกุลม้าวิ่งเพื่อการค้าต่อไปในอนาคต

คำสำคัญ