การสร้างรีคอมพ์บิแนนท์โปรตีนสำหรับเอนไซม์ ไฟว์อัลฟารีดักเทส ชนิดที่ 1 ของมนุษย์ในแบคทีเรีย
ชื่อผู้แต่งข้างต้นเป็นข้อความจากระเบียนผลงาน ไม่ได้ผูกกับรหัสนักวิจัย จึงกดดูผลงานอื่นของบุคคลนี้ไม่ได้ — ในคลังนี้ 142,080 ผลงาน (63.6% ของทั้งหมด) มีชื่อผู้แต่งที่เชื่อมกับหน้าผู้แต่งได้ และ 60,298 ผลงาน (27.0%) มีผู้แต่งที่ผูกกับรหัสนักวิจัยจริง ส่วนอีก 81,382 ผลงานไม่มีข้อมูลผู้แต่งเลย (มีชื่อผู้แต่งเป็นข้อความอยู่ 142,009 ผลงาน = 63.5%)
บทคัดย่อ
โรคผมบางจากฮอร์โมนเพศชาย (androgenetic alopecia) เป็นภาวะทางกายภาพของผมร่วงศีรษะล้านแบบมีรูปแบบที่จำเพาะเนื่องจากมีระยะการเจริญเติบโตของเส้นผมสั้นลง และเซลล์ปลายรากผมฝ่อ โดยปัจจัยหลักที่ทำให้เกิดโรคดังกล่าวคือ ฮอร์โมนไดไฮโดรเทสโทสเทอโรน เอนไซม์ไฟว์อัลฟารีดักเทส ชนิดที่ 1 ของมนุษย์ (5AR1) เป็นเอนไซม์ที่เยื่อหุ้มเซลล์ ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาโดยใช้ NADPH เป็นโคแฟคเตอร์ เปลี่ยนฮอร์โมนเทสโทสเทอโรนให้เป็นไดไฮโดรเทสโทสเทอโรน ซึ่งเกี่ยวข้องในการยับยั้งการเจริญของเซลล์รากผม ดังนั้นเอนไซม์ไฟว์อัลฟารีดักเทส ชนิดที่ 1 ของมนุษย์จึงเป็นเป้าหมายที่สำคัญในการพัฒนาสารยับยั้ง เพื่อการบรรเทาหรือรักษาโรคผมบางจากฮอร์โมนเพศชาย การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างยีนสังเคราะห์สำหรับเอนไซม์ไฟว์อัลฟารีดักเทส ชนิดที่ 1 ของมนุษย์ และผลิตเอนไซม์โดยใช้ระบบการผลิตรีคอมพ์บิแนนท์โปรตีนโดยอาศัยเซลล์เจ้าบ้านแบคทีเรีย วิธีการศึกษาเริ่มจากการศึกษาข้อมูลยีน และทำการปรับเปลี่ยนลำดับนิวคลีโอไทด์ให้เหมาะสมต่อการแสดงออกใน E. coli ทำการสังเคราะห์ดีเอนเอในรูปแบบชิ้นส่วนแบ่งออกเป็นสองชิ้น จากนั้นทำการต่อชิ้นส่วนดีเอนเอด้วยวิธี Gibson assembly เพื่อให้ได้ชิ้นดีเอนเอ 5AR1 ที่สมบูรณ์ขนาด 780 bp จากนั้นเพิ่มจำนวนดีเอนเอด้วยเทคนิค PCR โดยใช้ high-fidelity DNA polymerase ทำการต่อชิ้นดีเอนเอเข้ากับ pJET1.2/blunt plasmid vector และ transformed เข้าสู่ E. coli XL1-blue ตรวจสอบโคลนโดยใช้วิธี colony PCR, restriction analysis และ automated DNA sequencing ผลที่ได้จากโคลนที่ตรวจสอบมีลำดับนิวคลีโอไทด์ตรงกับยีนสังเคราะห์ที่ออกแบบทุกประการ จากนั้นทำย้ายชิ้นดีเอนเอเข้าสู่ระบบ pLW01 expression vector และนำเข้าสู่ E. coli C43(DE3) ตรวจสอบโคลนโดยใช้วิธี colony PCR, restriction analysis และ automated DNA sequencing 5AR1/pLW01 ที่บรรจุใน E. coli C43(DE3) เหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออก ตรวจสอบการแสดงออกในระดับ mRNA พบว่าสามารถกระตุ้นให้เกิดการแสดงออกของ 5AR1 ในระดับ mRNA ที่เวลา 2, 4 และ 8 ชั่วโมง รีคอมพ์บิแนนท์โปรตีน 5AR1 ถูกเชื่อมต่อกับ 3xFLAG peptide ในบริเวณปลาย C-terminus เพื่อส่งเสริมการแสดงออกและแยกบริสุทธิ์โปรตีน โดยประสบความสำเร็จในการแสดงออกของรีคอมพ์บิแนนท์โปรตีน 5AR1 ภายใต้ T7 promoter เมื่อถูกเหนี่ยวนำด้วย 0.7 มิลลิโมลาร์ IPTG ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 8 ชั่วโมง และใช้ 1% NP-10 เป็นสารช่วยละลายโปรตีนที่เยื่อหุ้มเซลล์ การแยกบริสุทธิ์โปรตีน 5AR1-3xFLAG