การแยกเพศต้นอินทผลัมที่ได้จากการเพาะเมล็ดโดยสัณฐานวิทยา โปรติโอมิกส์และเมทาบอโลมิกส์

บทคัดย่อ

การทำวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อแยกเพศต้นอินทผลัมที่ได้จากการเพาะเมล็ดโดยสัณฐานวิทยา โปรติโอมิกต์ และเมทาโบไลท์ ทำการศึกษา ณ สาขาไม้ผล คณะผลิตกรรมการเกษตร และคณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ จังหวัดเชียงใหม่ และแปลงปลูกอินทผลัมของเกษตรกรที่ใช้ต้นจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่สามารถระบุเพศดอกได้แล้ว จากการศึกษาพบว่า ลักษณะสัณฐานวิทยาด้านต่าง ๆ เช่น ลักษณะใบต่าง ๆ สีใบ ค่าแสงส่องผ่านของใบ และปริมาณธาตุอาหารในใบ ยังไม่สามารถระบุเพศดอกได้ชัดเจน นอกจากนี้อาจต้องใช้เวลาหลายปีเพื่อบันทึกว่าต้นที่แยกไว้นั้นเป็นเพศผู้ หรือเพศเมียตามสมุมติฐานที่ตั้งไว้ สำหรับการศึกษาด้านโปรตีโอมิกส์ในใบอินทผลัมเพศผู้ด้วยวิธีการสกัดทั้ง 2 3 วิธี โดยนำตัวอย่างมาวิเคราะห์แบบแผนโปรตีนด้วยเทคนิคเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสที่ย้อมด้วยโคแมสซี่บิลเลี่ยนบลู อาร์ 250 โดยทำการศึกษาหาวิธีการสกัดโปรตีนจากใบอินทผลัมเพศผู้แล้วนำมาทดสอบหาวิธีที่เหมาะสม เพื่อนำไปวิเคราะห์การแสดงออกทางโปรตีนด้วยเทคนิคเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสทั้งในสภาวะเจลแบบเนทีฟ และนอน-เนทีฟ (โซเดียมโดดิซิลซัลเฟตพอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส) และสภาวะตัวอย่างแบบรีดิวซิง และนอน-รีดิวซิง พบว่าปริมาณโปรตีนเฉลี่ยในวิธีการสกัด M3 ซึ่งประกอบด้วย ฟีนอล/กรดไตรคลอโรอะซิติกให้ปริมาณโปรตีนสูงสุด (14.27 ? 5.72 ไมโครกรัมต่อลิตร) มากกว่าวิธี M1 ซึ่งประกอบด้วยทริส-ไฮโดรคลอไรด์ บัฟเฟอร์ พีเอช 7.2 ความเข้มข้น 5 มิลลิโมลาร์ (4.00 ? 0.81 ไมโครกรัมต่อไมโครลิตร) และ M2 ซึ่งประกอบด้วยทริส-ไฮโดรคลอไรด์ บัฟเฟอร์ พีเอช 8.8 ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ (0.38 ? 0.09 ไมโครกรัมต่อไมโครลิตร) หลังจากนั้นทำการศึกษาการแสดงออกโปรตีนที่เจล 7.5%, 12.5% และ 15.0% แบบโซเดียมโดดิซิลซัลเฟตพอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟรีซิสโดยใช้ปริมาณ 60 ไมโครกรัมต่อหลุม ที่สภาวะตัวอย่างรีดิวซิง พบว่าที่ 7.5% เจล ไม่พบแถบโปรตีนในวิธีทั้ง 3 วิธี (M1-M3) สำหรับ 12.5% เจล พบว่าวิธี M1 และ M2 ไม่ปรากฎแถบโปรตีน แต่วิธีการ M3 มี 14 แถบโปรตีน (15.01, 17.17, 20.00, 21.59, 24.42, 27.07, 31.73, 35.00, 41.39, 44.36, 46.60, 55.93, 64.31 และ 74.23 กิโลดัลตัน ตามลำดับ) ในส่วนของ 15.0% เจล พบว่าวิธี M1 และ M2 ไม่ปรากฎแถบโปรตีนเช่นเดียวกันกับ 12.5% เจล แต่วิธีการ M3 มี 10 แถบโปรตีน (54.47, 45.62, 40.30, 30.71, 26.11, 23.26, 20.13,17.88, 15.61 และ 14.00 กิโลดัลตัน ตามลำดับ) ดังนั้นวิธี M3 ซึ่งปรากฎจำนวนแถบโปรตีน และความคมชัดมากที่สุดเหมาะสมในการสกัดโปรตีนจากใบอินทผลัมเพศผู้ และความเข้มข้นที่ 12.5 % เจล ดังนั้นวิธี M3 เมื่อนำมาศึกษาสภาวะที่เหมาะสมเพื่อให้จำนวนแถบโปรตีน และความคมชัดมากที่สุดคือ ความเข้มข้นที่ 12.5% เจล ที่ 60 ?g ต่อหลุม ในสภาวะแบบรีดิวซิง มีความเหมาะสมที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิส และเมื่อทำการวิเคราะห์ชนิดของโปรตีนวิธี M3 ในใบอินทผลัมด้วยเทคนิคลิควิชโครมาโทกราฟีแมสสเปกโทรเมทรี จากจำนวน 14 แถบ มีโปรตีนจำนวน 7 แถบ ที่สามารถวิเคราะห์ชนิดโปรตีนได้ ซึ่งเป็นโปรตีนโครงสร้าง (structural protein) พบ 3 ชนิด ได้แก่ ไรบูโลส 1,5- บิสฟอสเฟต คาร์บอกซีเลส (ribulose bisphosphate carboxylase) จำนวน 4 ชิ้น (23.83, 40.91, 52.64 และ 54.27 กิโลดัลตัน) อัลตราไวเลต-บี รีแคปเตอร์ ยูวีอาร์8 ไอโซฟอร์ม (ultraviolet-B receptor UVR8 isoform) 40.91 กิโลดัลตัน และโปรตีนโครงสร้าง (structural maintenance of chromosomes protein) 133.23 กิโลดัลตัน การเปรียบเทียบการแสดงออกโปรตีนเพศผู้ และเพศเมียในต้นอินทผลัมจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ พบว่าในตัวอย่างเพศผู้ และเพศเมียทั้ง 5 ตัวอย่าง มีแถบปรากฏเท่ากันจำนวณ 9 แถบ (10.98, 18.39, 19.51, 21.97, 24.80, 35.84, 48.94, 66.56 และ 85.31 กิโลดัลตัน ตามลำดับ) และมีตัวบ่งชี้ในการแยกเพศในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จำนวน 3 โปรตีนได้แก่ uncharaterized protein, ribulose bisphosphate carboxylase large chain (fragment) และ probable nucleoredoxin 3 ตามลำดับ สำหรับการเปรียบเทียบการแสดงออกโปรตีนเพศผู้ และเพศเมียในการเพาะเมล็ด พบว่าในตัวอย่างเพศผู้ และเพศเมีย มีแถบปรากฏเท่ากันจำนวณ 11 แถบ (13.25, 16.53, 17.78, 21.08, 25.08, 27.82, 33.39, 41.63, 55.77, 61.47 และ 85.45 กิโลดัลตัน ตามลำดับ) โดยไม่พบตัวบ่งชี้การแยกเพศในการเพาะเมล็ด และ เมื่อใช้เทคนิค Label-free Nano-LC-MS/MS analysis โดยพบชนิดโปรตีนในเพศผู้มีจำนวน 142 โปรตีน และเพศเมียมีจำนวน 103 โปรตีน โดยมีโปรตีนที่พบร่วมกันทั้งเพศผู้และเพศเมียมีจำนวน 136 โปรตีน เมื่อทำการวิเคราะห์บทบาทและหน้าที่ของแต่ละชนิดโปรตีน พบกลุ่มหน้าที่โปรตีนในเพศผู้จำนวน 21 กลุ่ม และเพศเมียมีจำนวน 24 กลุ่ม และมีกลุ่มโปรตีนที่พบร่วมกันทั้งเพศผู้และเพศเมียจำนวน 26 กลุ่ม ดังนั้นจะเห็นว่าสารที่สกัดได้ด้วยวิธี M3 และการใช้เทคนิค Label-free Nano-LC-MS/MS analysis มีประสิทธิภาพในการใช้ระบุโปรตีนการบ่งชี้เพศในใบอินทผลัมที่ได้จากการเพาะเมล็ด แต่เป็นเทคนิคที่มีค่าใช้จ่ายสูง และมีความยุ่งยากในการแปลผลไม่เหมาะกับการพัฒนาชุดทดสอบสำเร็จรูป จึงควรหาเทคนิคอื่น เช่นเทคนิค 2-dimensional electrophoresis (2D-gel) เพื่อใช้หาโปรตีนบ่งชี้เพศที่พบในเจลมาพัฒนาต่อเป็นชุดวิธีทดสอบสำเร็จรูปได้ต่อไปในอนาคต ขณะเดียวกันการศึกษาการแยกเพศของใบอินทผลัมเพศเมียจากเพศผู้ ด้วยการวิเคราะห์ปริมาณสารฟีนอลิกรวมไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของสารเมทาโบไลท์ระหว่างตัวอย่างเพศผู้และเพศเมีย และเมื่อทำการวิเคราะห์ ด้วยการใช้เครื่อง LC-QTOF MS ที่มีความละเอียดสูง ร่วมกับการวิเคราะห์ด้วยสถิติแบบหลายตัวแปรพบว่า ใบอินทผลัมที่ได้จากเทคนิคเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสามารถแยกออกจากใบอินทผลัมที่ได้จากการเพาะเมล็ดได้อย่างชัดเจน ผลการวิเคราะห์ พบว่าการลดลงของสารเมทาโบไลท์ 11 ชนิด เป็นตัวบ่งชี้สำคัญที่ทำให้อินทผลัมเพศเมียปลูกจากเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อแตกต่างจากอินทผลัมเพศผู้ อย่างไรก็ตามสำหรับการแยกเพศในอินทผลัมที่ปลูกจากเมล็ดกระทำได้ยากยิ่ง แต่ผลการวิเคราะห์แถบเมทาโบไลท์อย่างเข้มข้นค้นพบว่า อินทผลัมที่ปลูกจากเมล็ดเพศเมียแตกต่างจากเพศผู้เนื่องจากสารเมทาโบไลท์ ได้แก่ 383.0887931, 439.0743867 และ 515.1124467 Da ตามลำดับ องค์ความรู้ที่ได้นี้จะนำไปสู่การสืบค้นที่เข้มข้นเพื่อระบุชื่อของสารเมทาโบไลท์สำคัญทั้งหมดที่กล่าวแล้วข้างต้น เพื่อประโยชน์ในการคัดแยกอินทผลัมสองเพศนี้จากกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในระยะที่พืชยังอยู่ในวัยอ่อน (juvenile phase) ซึ่งจะช่วยให้เกษตรสามารถตัดสินใจลงทุนการเพาะปลูกอินทผลัมได้อย่างแม่นยำ เพื่อสร้างกำไรได้สูงสุด คำสำคัญ: อินทผลัม ต้นกล้า สัณฐานวิทยา ดอกเพศผู้ ดอกเพศเมีย การสกัดโปรตีน โปรตีโอมิกส์ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เมทาโบโลมิกส์

คำสำคัญ