การพัฒนาวิธีการแยกเพศอสุจิอย่างง่ายด้วยการกระตุ้น TLR7/8 บนโครโมโซม X ในโคและกระบือปลัก

บทคัดย่อ

วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้ เพื่อหาวิธีอย่างง่ายและมีประสิทธิภาพสูงในการคัดเลือกเพศอสุจิ โดยเพิ่มสัดส่วนเพศของโคนมและกระบือที่ต้องการให้ได้ปริมาณมากขึ้น ลดการสูญเสียโอกาสในการผลิต โดยการศึกษาผลของการกระตุ้น TLR7/8 บนโครโมโซม X ด้วยสาร Resiquimod (R848) ในเซลล์อสุจิโคนมและกระบือต่อประสิทธิภาพการแยกเพศเซลล์อสุจิเพศเมียและอสุจิเพศผู้ โดยใช้กระบือปลักพ่อพันธุ์ อายุ 4-11 ปี จำนวนทั้งหมด 4 ตัว และโคนม อายุ 3-5 ปี จำนวนทั้งหมด 8 ตัว ทำการรีดน้ำเชื้อและแบ่งน้ำเชื้อออกเป็น 3 กลุ่ม คือ กลุ่มน้ำเชื้อแช่แข็งที่ไม่ผ่านการแยกเพศ (unsorted frozen semen) และกลุ่มน้ำเชื้อที่ผ่านการแยกเพศผู้ (Y-enriched frozen semen) และกลุ่มน้ำเชื้อที่ผ่านการแยกเพศเมีย (X-enriched frozen semen) ด้วยสาร Resiquimod (R848) จากนั้น ทำการประเมินคุณภาพน้ำเชื้อทั้ง 3 กลุ่ม หลังจากแช่แข็ง การประเมินสัดส่วนเพศจากน้ำเชื้อแยกเพศด้วยสาร Resiquimod (R848) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ (Real-time PCR) การประเมินสัดส่วนเพศจากน้ำเชื้อแยกเพศด้วยสาร Resiquimod (R848) ด้วย sorted flow cytometry และทดสอบประสิทธิภาพของน้ำเชื้อแยกเพศด้วยการปฏิสนธิในหลอดแก้ว (in vitro fertilization) ผลการศึกษาในกระบือ พบว่า น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ไม่ผ่านการแยกเพศ มีเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ทั้งหมด (total motility; %) สูงกว่ากลุ่มที่ผ่านการแยกเพศเมียและเพศผู้ อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (49.72?5.32a, 22.03?3.03b และ 27.27?4.42b ตามลำดับ) ในกลุ่มที่ผ่านการแยกเพศเมียเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติกับกลุ่มน้ำเชื้อแยกเพศผู้ ขณะที่เปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ไปข้างหน้า (progressive motility; %) พบว่า น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ไม่ผ่านการแยกเพศมีเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ไปข้างหน้าสูงกว่ากลุ่มที่ผ่านการแยกเพศเมียและเพศผู้ อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (24.85?3.37a, 8.00?1.36b และ 10.37?1.40b ตามลำดับ) ขณะที่การศึกษาความสัมพันธ์ของยีน SRY ที่เป็นยีนบ่งชี้เพศผู้ในการตรวจสอบประสิทธิภาพของสาร Resiquimod (R848) ต่อสัดส่วนเพศจากน้ำเชื้อแยกเพศ พบว่า กลุ่มน้ำเชื้อที่ผ่านการแยกเพศผู้ (upper layer) มีค่าความสัมพันธ์การแสดงออกของยีน SRY สูงกว่ากลุ่มน้ำเชื้อที่ไม่ผ่านการแยกเพศ เท่ากับ 4.3 เท่า และกลุ่มน้ำเชื้อที่ผ่านการแยกเพศเมีย (lower layer) เท่ากับ 3.5 เท่า อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ขณะที่กลุ่มน้ำเชื้อแยกเพศเมียด้วย มีค่าความสัมพันธ์การแสดงออกของยีน SRY ต่ำกว่ากลุ่มน้ำเชื้อที่ไม่ผ่านการแยกเพศแต่ไม่มีความแตกต่างทางสถิติ (p>0.05) เมื่อนำน้ำเชื้อไปวิเคราะห์ด้วยเครื่อง sorted flow cytometry ผลการศึกษา พบว่า น้ำเชื้อแช่แข็งกระบือที่ไม่ผ่านการแยกเพศ (unsorted frozen semen) มีเปอร์เซ็นต์ของเซลล์อสุจิเพศผู้ (Y sperm) และเซลล์อสุจิเพศเมีย (X sperm) ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ (p>0.05) ขณะที่น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ผ่านการแยกเพศเมีย (X-enriched frozen semen) มีเปอร์เซ็นต์เซลล์อสุจิเพศเมีย (X sperm) สูงกว่าเพศผู้ (Y sperm) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (71.81?1.33a และ 27.23?1.48 ตามลำดับ) น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ผ่านการแยกเพศผู้ (Y-enriched frozen semen) มีเปอร์เซ็นต์เซลล์อสุจิเพศผู้ (Y sperm) สูงกว่าเพศเมีย (X sperm) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (86.08?2.42a และ 13.60?2.61) เมื่อทดสอบประสิทธิภาพของน้ำเชื้อต่ออัตราการผสมติด พบว่า กระบือที่ได้รับการผสมเทียมด้วยน้ำเชื้อที่ไม่ผ่านการแยกเพศมีเปอร์เซ็นต์ผสมติด เท่ากับ 84.62% ขณะที่กระบือที่ได้รับการผสมเทียมด้วยน้ำเชื้อแยกเพศเมียมีเปอร์เซ็นต์การผสมติด เท่ากับ 68.75 % ส่วนกระบือที่ได้รับการผสมเทียมด้วยน้ำเชื้อแยกเพศผู้มีเปอร์เซ็นต์การผสมติด เท่ากับ 77.77 % ซึ่งจะเห็นได้ว่าน้ำเชื้อที่ผ่านการแยกเพศเมียและเพศผู้ไม่มีผลต่ออัตราการผสมติดในกระบืออย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ขณะผลการศึกษาโคนม พบว่า น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ไม่ผ่านการแยกเพศ มีเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ทั้งหมด (total motility; %) สูงกว่ากลุ่มที่ผ่านการแยกเพศเมียด้วย อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (54.88?2.17a, 25.28?4.09b และ 45.73?4.90a ตามลำดับ) แต่ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติกับกลุ่มน้ำเชื้อแยกเพศผู้ ขณะที่เปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ไปข้างหน้า (progressive motility; %) พบว่า น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ไม่ผ่านการแยกเพศและกลุ่มที่ผ่านการแยกเพศผู้ มีเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ไปข้างหน้าไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ (p>0.05) (21.93?1.55ab และ28.65?3.89a ตามลำดับ) แต่กลุ่มน้ำเชื้อที่แยกเพศผู้มีเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ไปข้างหน้าสูงกว่ากลุ่มน้ำเชื้อที่แยกเพศเมียอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (28.65?3.89a และ10.58?2.02b ตามลำดับ) ขณะที่ ในการศึกษาความสัมพันธ์ของยีน SRY ที่เป็นยีนบ่งชี้เพศผู้ในการตรวจสอบประสิทธิภาพของสาร Resiquimod (R848) ต่อสัดส่วนเพศจากน้ำเชื้อแยกเพศ พบว่า กลุ่มน้ำเชื้อที่ผ่านการแยกเพศผู้ (upper layer) มีค่าความสัมพันธ์การแสดงออกของยีน SRY สูงกว่ากลุ่มน้ำเชื้อที่ไม่ผ่านการแยกเพศ 4.1 เท่า และกลุ่มน้ำเชื้อที่ผ่านการแยกเพศเมีย (lower layer) 3.47 เท่า อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ขณะที่กลุ่มน้ำเชื้อแยกเพศเมีย มีค่าความสัมพันธ์การแสดงออกของยีน SRY ต่ำกว่ากลุ่มน้ำเชื้อที่ไม่ผ่านการแยกเพศแต่ไม่มีความแตกต่างทางสถิติ (p>0.05) เมื่อนำน้ำเชื้อไปวิเคราะห์ด้วยเครื่อง sorted flow cytometry ผลการศึกษา น้ำเชื้อแช่แข็งโคนมไม่ผ่านการแยกเพศ (unsorted frozen semen) มีเปอร์เซ็นต์ของเซลล์อสุจิเพศผู้ (Y sperm) และเซลล์อสุจิเพศเมีย (X sperm) ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ (p>0.05) (43.48?4.25 และ 46.39?1.33) ขณะที่น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ผ่านการแยกเพศเมีย (X-enriched frozen semen) มีเปอร์เซ็นต์เซลล์อสุจิเพศเมีย (X sperm) สูงกว่าเพศผู้ (Y sperm) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (70.88?0.92a และ 28.45?0.91 ตามลำดับ) น้ำเชื้อแช่แข็งกลุ่มที่ผ่านการแยกเพศผู้ (Y-enriched frozen semen) มีเปอร์เซ็นต์เซลล์อสุจิเพศผู้ (Y sperm) สูงกว่าเพศเมีย (X sperm) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) (88.31?1.31a และ 11.09?1.39) เมื่อทดสอบประสิทธิภาพของน้ำเชื้อต่ออัตราการผสมติด พบว่า เปอร์เซลล์การแบ่งเซลล์ตัวอ่อนที่ทดสอบด้วยอสุจิที่ไม่ผ่านการแยกเพศ (unsorted frozen semen) และอสุจิที่ผ่านการแยกเพศผู้ (Y-enriched frozen semen) สูงกว่าอสุจิที่ผ่านการแยกเพศเมีย (X-enriched frozen semen) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ

คำสำคัญ