การพัฒนา Cell-based model สำหรับการศึกษา NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) nuclear-cytoplasm translocation และการประยุกต์ใช้ในการตรวจสอบสารออฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันจากสารสกัดพืชสมุนไพร

บทคัดย่อ

โปรตีน Nuclear factor of activated T-cells (NFATs) และ calcium ion มีบทบาทสําคัญในระบบภูมิคุ้มกันของ ร่างกาย กลุ่มโปรตีน NFAT family มีสมาชิกอย่างน้อย 4 ชนิด คือ NFAT1 (NFATp), NFAT2 (NFATc), NFAT3 และ NFAT4 (NFATx) วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อ การสร้าง Cell-based model สําหรับ NFAT nuclear-cytoplasm translocation เพื่อใช้ในการตรวจสอบสารออกฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน ทําการแยกยีน NFAT4 (N) และ NFAT3 (N) โดยไม่รวมส่วน transectivation domain หรือ Rel domain จาก human cDNA library จากนั้นทําการใส่ยีน green fluorescent protein หรือ GFP เข้าเชี่อมส่วนหน้าของ NFAT4 (N) และ NFAT3 (N) และตัดต่อยีน GFP-NFAT3(N) และ GFP-NFAT4(N) เข้าไปใน pcDNA 3.1 vector เพื่อสามารถเพิ่มจํานวนยีนใน DH5? strain E.coli เซลล์Baby Hamster Kidney (BHK) และ primary porcine skin fibroblasts ทํามาใช้ในการทดลอง โดยเพาะเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยง modified Eagle’s medium ที่มี 5% fetal bovine serum และเสริมด้วย100U/ml penicillin และ 100?g/ml streptomycin จากนั้นนํา vector ที่มียีนต่างๆที่เตรียมไว้ดังนี้ GFP vector ซึ่งทําหน้าที่เป็น negative control GFP-NFAT3(N) vector ทําหน้าที่เป็น dominant negative control และ GFP-NFAT4(N) vector นําส่งเข้าไปในเซลล์ของ BHK cells และ primary porcine skin fibroblasts โดยใช้สารช่วยนําส่งคอื Lipofectamine 2000 (บริษัท Invitrogen) หลังการนํายนเข ี ้าเซลล์จะทําการเลี้ยงเซลล์ต่อไปอีกประมาณ 24 ชั่วโมงเพื่อให้มีการแสดงออกของ โปรตีนที่แปลงรหัสจากยีนที่นําส่งเข้าไปในเซลล์จากนั้นทําการศกษาร ึ ูปแบบการเคลื่อนที่เข้า-ออกระหว่าง nucleus และ cytoplasm ของโปรตีน GFP, GFP-NFAT3(N) และ GFP-NFAT3(N)โดยการเติมสารเพิ่มปริมาณ calcium ion ใน cytoplasm คือสาร calcium ionophore (A23187) ปริมาณความเข้มข้นที่ (1?M) หรือ cyclosporin A (CsA) ที่ความ เข้มข้น 2 ระดับ (1 และ 5?M) ซึ่ง CsA เป็นสารยับยั้งการทํางานของโปรตีน calcineurin ซึ่งเป็น phosphatase enzyme ภายในเซลล์ที่ชวยในการน ่ ําเข้าโปรตีน NFAT จาก cytoplasm สู่ nucleus การติดตามสามารถใช้สัณญาณจากการเรืองแสง ของโปรตีน GFP โดยกล้อง inverted fluorescent microscope (Carl Zeiss) สุดท้ายทําการถ่ายภาพผลการทดลองและ วิเคราะห์ผล จากการติดตามสัณญาณจากการเรืองแสงของโปรตีน GFP โดยกล้อง inverted fluorescent microscope พบว่าในกลุ่ม เซลล์ที่ได้รับยีน GFP มีสัณญาณจากการเรืองแสงของโปรตีน GFP ทั้งในส่วน nucleus และ cytoplasm (ทั้งจากการเติมสาร A23187 และร่วมกับ CsA) ซึ่งแสดงว่า GFP มีผลรบกวนต่อการทดลองน้อยมาก ในทางตรงข้ามกลุ่มเซลล์ที่ได้รับยีน GFPNFAT4(N) จะมีสัณญาณจากการเรืองแสงของโปรตีน GFP เข้าไปสะสมในส่วนของ nucleus อย่างชัดเจนเมื่อเติมสาร A23187 และสัณญาณจากการเรืองแสงของโปรตีน GFP จะลดลอย่างมากเมื่อเติมสาร A23187 และร่วมกับ CsA ซึ่งแสดงว่า โปรตีน NFAT4(N) ตอบสนองต่อระดับ calcium ion ที่เพิ่มขึ้นใน cytoplasm จากการกระตุ้นของสาร A23187 (โดยปริมาณ calcium ion ที่เพิ่มขึ้นใน cytoplasm มีผลต่อการทํางานของ โปรตีน calcineurin ซึ่งเป็น phosphatase enzyme ภายใน เซลล์) และผลนี้สามารถยับยั้งได้โดยการเติมสาร CsA ส่วนกลุ่มเซลล์ที่ได้รับยีน GFP-NFAT3(N) จะมีสัณญาณจากการเรือง แสงของโปรตีน GFP เข้าไปสะสมในส่วนของ nucleus ที่น้อยมากอย่างชัดเจนทั้งที่เตมสาร ิ A23187 และร่วมกับ CsA ซึ่ง แสดงว่าโปรตีน NFAT3(N) ไม่ตอบสนองต่อระดับ calcium ion ที่เพิ่มขึ้นใน cytoplasm จากการกระตุ้นของสาร A2318 อัน แสดงถึงการเป็น dominant negative ของโปรตีน NFAT3 อาศัยกระบวนการการชักนําให้เกิดการเพิ่มขึ้นของปริมาณความเข้มข้นของ calcium ion ใน cytoplasm และการ ใช้สาร CsA ในการยับยั้งการทํางานของโปรตีน calcineurin ในเซลล์ BHK cells และprimary ที่ผ่านกระบวนการนําส่งยีน NFAT4 (N) หรือ NFAT3 (N) ทีมผู้วิจัยได้เสนอผลการวิจัยถึงรูปแบบการเคลื่อนที่ระหว่าง nucleus และ cytoplasm ที่ เฉพาะของโปรตีนกลุ่ม NFAT (NFAT kinetic study) ซึ่งผลการศึกษาน้ยีืนยันได้ว่าฤทธิ์ของสาร A23187 จะเป็นแบบ transient และ reversible ส่วน CsA จะออกฤทธิ์ยั้บยังผลการเคลื่อนที่ของ NFAT4 ได้ดีและนาน (มากกว่า 24 ชั่วโมง) และป็นแบบ non-reversible และที่สําคัญฤทธิ์ชักนํา NFAT4 nuclear translocation ของสารกระตุ้น A23187 และฤทธ์ ยับยั้ง NFAT4 nuclear translocation ของสาร CsA เมื่อมีการใช้ยาร่วมกันพบว่า สาร A23187 จะไม่สามารถต้านการยับยั้ง NFAT4 nuclear translocation ของสาร CsA ได้แสดงถึงภาวะการยับยั้งเอ็มไซม์ calcineurin แบบ non-competitive irreversible ของสาร CsA ในการประยุกต์ใช้ในการสร้าง cell-based model สําหรับ NFAT nuclear-cytoplasm translocation เพื่อใช้ใน การตรวจสอบสารออฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันนั้น ผู้วิจัยได้คัดเลือกสมุนไพรที่มีรายงานทางเอกสารวิชาการล่าสุด ว่ามีฤทธิ์ในการกดการสร้าง interleukin 2 (IL-2) และมีผลต่อ T-cell signaling หรือมีการรายงานผลการกด T-cell activation โดยมีกลไกการออกฤทธิ์ผ่านการยับยั้ง calcium signaling และ NFAT activation ซึ่งได้แก่สารสกัด curcumin จากพืชขมิ้นชัน และ สารสกัด andrographolide จากพืชฟ้าทะลายโจร มาทําการทดลสอบโดย cell-based model นี้การ ทดลองพบว่า ทั้ง สาร curcumin และ andrographolide ไม่มีผลกระตุ้นหรือยับยั้งการเกิด NFAT activation ดังนั้นใน การศึกษานี้ผู้วิจยสามารถยืนยันได้ว่าผลการยับยั้งที่รายงานในงานวิจัยก่อนหน้านั้น ไม่น่าจะเกิดขึ้นผ่านทาง calcinuerin inhibition แต่น่าจะเป็นผลจากการยับยั้งในส่วนอื่นๆของ pathway หรือกลไกอื่นๆที่ไม่ผ่านทาง NFAT เช่น c-jun transcription factor และ NF-?B activation เป็นต้น

คำสำคัญ