การทำให้บริสุทธิ์และการศึกษาคุณสมบัติของไวเทลโลจีนินและการโคลนยีนไวเทลโลจีนินจากตับของกุ้งแชบ๊วย

บทคัดย่อ

พัฒนาการเจริญพันธุ์ของกุ้งเพศเมียถูกแสดงออกโดยการเพิ่มขนาดของรังไข่ซึ่งเป็นผลมาจาก การสะสมไวเทลลินที่เป็นโปรตีนหลักของโปรตีนโยล์คในข่กุ้งแชบ๊วย ในครัสเตเชียน ไวเทลลินอาจถูก สร้างในรังไข่และบางส่วนอาจได้มาจากไวเทลโลจีนินที่สร้างในตับผ่านทางฮีโมลิมฟ์ ในงานวิจัยนี้ ได้ทำ ให้ไวเทลโลจีนินบริสุทธิ์จากฮีโมลิมฟ์ของแม่กุ้งแชบ๊วยด้วยวิธีอัลตราเซนตริฟิวจ์ และตามด้วยการทำโพลี อะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบเตรียม (Preparative PAGE)ไวเทลโลจีนินบริสุทธิ์มีมวลโมเลกุล 432 KDa เมื่อวิเคราะห์ด้วยคอลัมน์ Superdex 200 จากการทำ SDS-PAGE พบว่ไวเทลโลจีนินบริสุทธิ์ ประกอบด้วย 2 หน่วยย่อยหลักขนาด 87 และ 78 kDa และ 2 หน่วยย่อยรอง (200 และ 104 KDa) ไวเทล โลจีนินบริสุทธิ์ยังเกิดปฏิกิริยากับแอนติบอดีต่อไวเทลลินบริสุทธิ์ (Ani-V) เมื่อวิเคราะห์โดย Western blot เพื่อศึกษาโครงสร้างปฐมภูมิของไวเทลโลจีนินจากตับของกุ้งแชบ๊วย ได้โคลน CDNA ที่ encode ไวเทลโลจีนิน โดยใช้ข้อมูลลำดับกรดอะมิโนด้านปลายเอ็นของหน่วยย่อย 78 kDa ของกุ้ง แชบ๊วยและ conserved sequence ของยีนไวเทลลินไวเทลโลจีนินของกุ้งชนิดอื่น full-length Vg CDNA ที่ได้จากการทำ RT-PCR ของ RNA ที่สกัดมาจากตับและด้วยวิธี 5- และ 3-RACE ประกอบด้วย 7,958 nucleotide มี1 open reading frame ซึ่ง encode เปปไทด์ยาว 2,587 amino acid ยี่นไวเทล โลจีนินยังมีตำแหน่ง R-X-K/R-R 1 ตำแหน่ง และมีหลาย dibasic motif (RTRR) ที่ถูกตัดได้โดยเอนไซม์ endo-protease กลุ่ม subtilisin การตัดสายเปปไทด์ด้วยเอนไซม์ชนิดนี้ทำให้ได้สายเปปไทด์ขนาด 87 kDa /78 kDa และ 200 kDaหน่วยย่อยหลักขนาด 87 และ 78 KDa ของไวเทลโลจีนินบริสุทธิ์อาจมา จากสายเปปไทด์เดียวกันเนื่องจากมีลำดับกรดอะมินด้านปลายเอ็นเหมือนกัน แต่มีขนาดต่างกันอาจเกิด จากการดัดแปลงหลังการสร้างโปตีน หน่วยย่อย 104 kDa อาจได้มาจากการตัดภายในสายเปปไทด์ 200 kDa เพราะมีลำดับกรดอะมิในด้านปลายเอ็นเหมือนกัน โครงสร้างปฐมภูมิของยืนไวเทลโลจีนินจาก ตับมีความเหมือนกับยีนไวเทลลินในรังไข่ของกุ้งแชบ๊วย 98.7% บ่งชี้ว่าเป็นยีนเดียวกัน นอกจากนี้ยังมี ความเหมือน กับยีนของกุ้ง Penacus chinensis มากที่สุด 94% และคล้ายกับของกุ้งพีเนดชนิดอื่นๆ ในช่วง 91.4 - 64% จากการวิเคราะห์ด้วยวิธี RT-PCR พบการแสดงออกของ Vg mRNA ทั้งในตับและรังไข่ของแม่ กุ้งแชบ๊วย ไม่พบในเนื้อเยื่ออื่นของแม่กุ้งหรือในตับของพ่อกุ้ง ผลวิจัยนี้บ่งชี้ว่ามีการแสดงออกของยีน ไวเทลโลจีนินเฉพาะในแม่กุ้งแชบ๊วย และทั้งตับและจังไข่เป็นแหล่งสังเคราะห์ไวเทลโลจีนินไวเทลลิน ใน การวิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกของ Vg mRNA ด้วยวิธี real-time PCR พบว่า Vg mRNA มี ระดับต่ำในระยะ 1 ก่อนการสะสมไวเทลลิน และมีระดับเพิ่มขึ้นจนสูงสุดในรังไข่ในช่วงเริ่มการสะสมไว เทลลิน (ระยะ 2) หรือสูงสุดในตับในช่วงการสะสมไวเทลลิน (ระยะ 3) ก่อนระดับ Vg mRNA ลดลงเมื่อ ไข่เจริญพันธุ์ (ระยะ 4) มีการแสดงออกของ Vg mRNA ในรังไข่สูงกว่าในตับมากตลอดช่วงพัฒนาการเจริญพันธุ์ทุกระยะ ซึ่งสอดคล้องกับการพบปริมาณไวเทลลินในรังไข่สูงกว่าปริมาณไวเทลโลจีนินในฮีโม ลิมพ์ตลอดช่วงของการพัฒนาการเจริญพันธุ์ของรังไข่ บ่งชี้ว่ารังไข่เป็นเนื้อเยื่อหลักในการสร้างไวเทลลิน ในกุ้งแชบ๊วย

คำสำคัญ