การศึกษาลักษณะทางพันธุกรรมและกลไกการก่อโรคของเชื้อ Streptococcus suis ซีโรไทป์ 2 สายพันธุ์ที่แยกได้จากผู้ติดเชื้อในเขตภาคเหนือของประเทศไทย

บทคัดย่อ

Streptococcus suis (S. suis) เป็นเชื้อก่อโรคที่สำคัญในสุกรทั่วโลกและสามารถก่อให้เกิดการติดเชื้อเข้าสู่มนุษย์ได้ ลักษณะทางคลินิกในมนุษย์ ได้แก่ เยื่อหุ้มสมองอักเสบ ภาวะโลหิตเป็นพิษ โรคข้ออักเสบ โรคปอดอักเสบ อาการท็อกซิกช็อกเนื่องจากกลุ่ม Streptococcus (STSS) และแม้กระทั่งเสียชีวิตอย่างเฉียบพลัน S. suis ซีโรไทป์ 2 (SS2) เป็นซีโรไทป์ที่พบบ่อยที่สุดและก่อโรคบ่อยที่สุดทั้งในสุกรและมนุษย์โดยเฉพาะในยุโรปและเอเชีย ในประเทศไทย การติดเชื้อในมนุษย์ของ S. suis ส่วนใหญ่มาจากภาคเหนือของประเทศไทยและเชื้อที่แยกได้ส่วนใหญ่เป็นซีโรไทป์ 2 โดยปกติแล้วการแยกความแตกต่างระหว่างเชื้อ S. suis สายพันธุ์ที่รุนแรงกับสายพันธุ์ไม่ก่อโรครุนแรงจะใช้ virulence factors/ genes markers 3 ยีน (sly, mrp, และ epf) แต่อย่างไรก็ตามมีการศึกษาเมื่อไม่นานมานี้หลายฉบับได้ชี้ให้เห็นว่า จากการศึกษาเชื้อ S. suis สายพันธุ์ที่รุนแรงที่แยกได้จากหลายๆแหล่งนั้น ตรวจไม่พบ virulence factors/genes markers ทั้ง 3 ตัวข้างต้น ในการศึกษาครั้งนี้ได้ทำการศึกษาถึงการกระจายตัวและการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของเชื้อ S. suis ซีโรไทป์ 2 จำนวน 62 ตัวอย่างที่แยกได้จากผู้ป่วยในภาคเหนือของประเทศไทย ยีนเหล่านั้นประกอบด้วย cps, epf, mrp, sly, hhly3, sspA, endoD, purD, dltA, pgdA, dppIV, SMU_61, rgg, salK/R, ciaR/H, Permease, และ virD4 โดยผลจากการศึกษาพบว่ามีการตรวจพบยีน virD4 ในเชื้อ S. suis ทุกสายพันธุ์ที่ใช้ศึกษา ซึ่งตรงกันข้ามกับยีน hhly3 ที่ตรวจไม่พบในทุกเชื้อที่ใช้ในการศึกษา ทั้งยีน virD และ hhly3 ต่างอยู่บนชิ้นส่วนของ 89K PAI ซึ่งเป็นชิ้นส่วน DNA ที่มีความจำเพาะเฉพาะต่อเชื้อ S. suis สายพันธุ์ที่แยกได้จากการระบาดครั้งใหญ่ในประเทศจีน จากการศึกษานี้ได้ทำการจำแนก S. suis ออกเป็น 20 virulence genotypes ที่แตกต่างกันตามการมียีนที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงในการก่อโรคของเชื้อ ซึ่งแสดงให้เห็นได้ว่าตัวอย่างที่แยกได้จากผู้ป่วยทางภาคเหนือของประเทศไทยนั้นมีความหลากหลายของยีนที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรคอย่างมาก หลังจากนั้นได้ทำการสุ่มเลือกตัวแทนของทั้ง 20 virulence genotypes ที่แตกต่างกันเพื่อการศึกษาการแสดงออกในหลอดทดลอง พบว่า ยีน sspA มีการแสดงออกในเชื้อทุกสายพันธุ์ที่ตรวจพบ (100%) ตามมาด้วย virD (95.0%) และ dltA (94.44%) แสดงให้เห็นว่า sspA, virD และ dltA นั้นอาจมีบทบาทสำคัญต่อความรุนแรงของเชื้อ เพื่อความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับการติดเชื้อที่รุนแรงของ S. suis การศึกษานี้ได้สร้างแบบจำลองการติดเชื้อโดยใช้ หนอน Caenorhabditis elegans (C. elegans) และทำการเปรียบเทียบการทดสอบระหว่าง solid assay และ liquid assay ผลการทดลองได้แสดงให้เห็นว่าวิธีการทดสอบแบบ solid assay นั้นให้อัตราการตายของหนอนต่ำกว่าและไม่แตกต่างกันชัดเจนในแต่ละ virulence genotype เมื่อเทียบการทดสอบแบบ liquid assay ดังนั้นเราจึงเลือกใช้การทดสอบแบบ liquid assay เพื่อตรวจสอบระดับความรุนแรงของเชื้อ S. suis ที่แตกต่างกันในแต่ละ virulence genotypes ผลการประเมินระดับความรุนแรงในการก่อโรคของเชื้อแต่ละ virulence genotype ที่แตกต่างกัน จำนวน 5 เชื้อโดยใช้หนอน C. elegans ทดสอบแบบ liquid assay ได้แก่ เชื้อตัวแทนจาก VG-01, VG-06, VG-11, VG-17 และ VG-18 โดยใช้ปริมาณเชื้อ S. suis 4 ความเข้มข้นคือ 2.5 x 104 CFU / ml, 5.0 x 104 CFU / ml, 7.5 x 104 CFU / ml และ 1.0 x 105 CFU / ml พบว่าเชื้อ S. suis VG-17 ก่อให้เกิดอัตราการตายของหนอนสูงที่สุด ตามด้วย VG-18, VG-11, VG-01 และ VG-06 ตามลำดับ การศึกษานี้เป็นการศึกษาครั้งแรกเพื่อประเมินความรุนแรงของเชื้อ S. suis โดยใช้ C. elegans ทั้งนี้ควรมีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกการฆ่า C. elegans และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของตัวหนอนเพื่อความเข้าใจและพัฒนา model นี้ให้ดียิ่งขึ้นต่อไป การตายแบบไพรอปโทซิสเป็นกลไกที่ระบบภูมิคุ้มกันใช้ในการควบคุมเชื้อจุลชีพที่อาศัยอยู่ภายในเซลล์ ปัจจุบันพบว่า pore-forming toxin ที่สร้างจากเชื้อแบคทีเรียแกรมบวกสามารถชักนำให้เซลล์เกิดการตายแบบไพรอปโทซิส เชื้อ Streptococcus suis เป็นเชื้อก่อโรคจากสัตว์สู่คนที่สำคัญตัวหนึ่ง เชื้อ S. suis บางสายพันธุ์มีการสร้างซุยไลซินซึ่งจัดอยู่ในกลุ่ม pore-forming toxin อย่างไรก็ตามยังไม่มีรายงานว่าซุยไลซินสามารถชักนำให้เกิดการตายแบบไพรอปโทซิส จากการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าเชื้อ S. suis สายพันธุ์ sly+ ที่แยกได้จากผู้ป่วย และสายพันธุ์ P1/7 สามารถกระตุ้นเอนไซม์แคสเปส-1 และชักนำให้เซลล์ U937 เกิดการตายแบบไพรอปโทซิส แม้ว่าผู้วิจัยไม่ได้ตรวจวัดปริมาณซุยไลซินที่เชื้อสร้าง แต่ได้ทดสอบความสามารถในการทำให้เม็ดเลือดแดงแตกและพบว่าการชักนำให้เกิดการตายแบบไพรอปโทซิสมีความสัมพันธ์โดยตรงกับความสามารถในการทำให้เม็ดเลือดแดงแตก แสดงให้เห็นว่าซุยไลซินหรือองค์ประกอบอื่นของเชื้อน่าจะมีบทบาทในการกระตุ้นเอนไซม์แคสเปส-1 และชักนำให้เกิดการตายแบบไพรอปโทซิส ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้ ผู้วิจัยจึงมุ่งที่จะศึกษาผลของซุยไลซินต่อการกระตุ้นเอนไซม์แคสเปส-1 และชักนำให้เกิดการตายแบบไพรอปโทซิส การศึกษาครั้งนี้ได้ทำการกลายพันธุ์ยีน sly ของเชื้อ S. suis สายพันธุ์ MNCM06 ได้เป็นเชื้อที่มีจีโนไทป์เป็น MNCM06 sly::cat ที่จะนำไปศึกษาจำนวน 4 โคลน เมื่อนำเชื้อ MNCM06 sly::cat ทั้ง 4 โคลนไปเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ U937 พบว่าการตายของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเซลล์ U937 ที่เลี้ยงร่วมกับเชื้อ MNCM06 wild type (p?0.0001) ผลการทดสอบนี้แสดงให้เห็นว่าซุยไลซินมีบทบาทในการชักนำให้เซลล์เกิดการตายแบบไพรอปโทซิสของเชื้อ S. suis สายพันธุ์ MNCM06 ทั้งนี้การกระตุ้นเอนไซม์แคสเปส 1 ของเชื้อ S. suis สายพันธุ์ MNCM06 เกิดจากการกระตุ้นผ่านทาง NLRP3 inflammasome และไม่ได้มีสาเหตุมาจาก K+efflux เช่นเดียวกับ pore-forming toxin อื่นๆ ที่น่าสนใจคือเชื้อ S. suis สายพันธุ์ MNCM55 (sly-) ที่ไม่มีการสร้างซุยไลซิน เมื่อเลี้ยงเซลล์ U937 ร่วมกับเชื้อในปริมาณน้อย (MOI=1) พบว่าเชื้อสายพันธุ์ MNCM55 สามารถชักนำให้เซลล์ U937 เกิดการตายแบบไพรอปโทซิสเมื่อเพาะเลี้ยงร่วมกันเป็นเวลา 12 และ 24 ชั่วโมง (8.91% และ 33.59% ตามลำดับ) จากการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นการตายแบบไพรอปโทซิสของเชื้อ S. suis ซีโรไทป์ 2 นั้นขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ของเชื้อ การที่เชื้อ S. suis กระตุ้น inflammasome และชักนำให้เกิดการตายแบบไพรอปโทซิสแตกต่างกันไปในแต่ละสายพันธุ์นั้น อาจส่งผลต่อพยาธิกำเนิดและการดำเนินของโรค ดังนั้นการศึกษาถึงกลไกที่เชื้อ S. suis ต่างสายพันธุ์ใช้ในการกระตุ้น inflamma- some และชักนำให้เกิดการตายแบบไพรอปโทซิสจะช่วยส่งเสริมความเข้าใจในการก่อโรคของเชื้อ S. suis ให้มากขึ้นได้ คำสำคัญ: สเตร็ปโตคอคคัส ซูอิส, Virulence genotyping, ซุยไลซิน, การติดเชื้อในหนอน Caenorhabditis elegans, inflammasome, แคสเปส-1, ไพรอปโทซิส

คำสำคัญ