การหาสภาวะที่เหมาะสมในการเลี้ยงไฟโบรบลาสต์ให้มีการแสดงออกคล้ายเซลล์ประสาทบนไฮโดรเจลที่มีส่วนผสมของไฮดรอกซีอะพาไทต์

บทคัดย่อ

ในปัจจุบันประเทศไทยกำลังเข้าสู่สังคมของผู้สูงอายุ ซึ่งหนึ่งในปัญหาสุขภาพของผู้สูงอายุ คือ โรคที่เกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท เมื่อไม่นานมานี้นักวิจัยได้ค้นพบเทคนิคใหม่ที่เรียกว่า cell reprogramming ซึ่งสามารถเปลี่ยนเซลล์ตัวแก่ชนิดหนึ่ง ไปเป็นเซลล์ชนิดต่าง ๆ ได้ เซลล์ตัวแก่ที่นิยมใช้ ในการทำ cell reprogramming คือ เซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (fibroblast) ปัจจุบันนักวิจัยสามารถเปลี่ยน เซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันไปเป็น pluripotent stem cell (iPSC) neural stem cell (iNSC) และเซลล์ของ อวัยวะอื่น ๆ อีกหลายชนิด ซึ่งในการศึกษานี้เราสนใจที่จะเปลี่ยนเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันไปเป็น iNSC ซึ่ง สามารถเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ประสาท neuron astrocyte และ oligodendrocyte ที่สามารถ นำไปใช้ในการรักษาโรค และในงานวิจัยทางการแพทย์ แต่ในการใช้ iNSCs ยังคงเป็นที่ถกเถียงกัน เนื่องจากการทำ cell reprogramming ต้องมีการบังคับให้เนื้อเยื่อเกี่ยวพันมีการแสดงออกของยีนของ ระบบประสาท โดยใช้ viral vector ร่วมกับการปรับเปลี่ยนทาง epigenetic ซึ่งมีผลเสีย คือ การเข้าจับ ของ viral vector บนยีนของเนื้อเยื่อเกี่ยวพันเป็นแบบสุ่ม ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้ได้มีแนวคิดในการใช้ ชีววัสดุในการเปลี่ยนเนื้อเยื่อเกี่ยวพันไปเป็นเซลล์ประสาท โดยจะเตรียมชีววัสดุจาก 10% gelatin โดย แบ่งเป็น 3 ชนิด ได้แก่ gelatin, gelatin ที่มีส่วนผสมของ hydroxyapatite (HA) และ gelatin ที่มี ส่วนผสมของ hydroxyapatite และเนื้อสมองหมู ซึ่งเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน ชนิด NIH/3T3 จะถูก เพาะเลี้ยงในชีววัสดุแต่ละชนิด แล้วทำการตรวจด้วย RT-PCR เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีน เปรียบเทียบกับเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันที่เลี้ยงในจานเพาะเลี้ยง และนอกจากนี้ยังมีการศึกษา PI3K activation ด้วยวิธี flow cytometry หลังจากเลี้ยงเซลล์บนชีววัสดุเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ที่เวลา 9 วัน ชีว วัสดุที่ผลิตจาก gelatin HA และเนื้อสมองหมู สามารถเหนี่ยวนำให้มีการแสดงออกของ transcription factor ได้แก่ Nfia Nfib Klf4 PtbP ซึ่งบ่งบอกว่าเซลล์มีแนวโน้มที่จะเปลี่ยนแปลงไปเป็น astrocyte โดย ผ่านช่วง neural progenitor โดยการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้อาจจะเกิดจากการะกระตุ้น PI3K/Akt และที่ 14 วันการแสดงออกของ Klf4 Nfib MAP2 CD44 และ SOX9 แสดงให้เห็นว่า เซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน มี แนวโน้มเปลี่ยนแปลงเป็น astrocyte การย้อมด้วย specific dye CDr3 และ CDr10b พบว่า specific dye CDr3 และ CDr10b ยังไม่มีความจำเพาะพอ เมื่อปรับปรุงเจลโดยเพิ่มปริมาณสมองหมูและทำการ เลี้ยงเซลล์ NIH/3T3 เป็นเวลา 23 วัน พบการแสดงออกของยีน MAP2 ซึ่งเป็น differentiation marker ของเซลล์ประสาท และยีน CD44 ซึ่งเป็น surface marker ของเซลล์ประสาท โดยมีการแสดงออกมาก ที่สุดในเซลล์ที่เลี้ยงใน hydrogel ที่มีส่วนผสมของ HA ซึ่งทั้ง MAP2 และ CD44 ถือเป็น marker ของ astrocyte และเมื่อทดสอบการแสดงออกของโปรตีน พบการแสดงออกของโปรตีน beta-III tubulin ซึ่ง เป็น marker ของ neuron ในเซลล์ที่เลี้ยงใน hydrogel แสดงให้เห็นว่าเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน NIH/3T3 มีแนวโน้มที่จะพัฒนาไปเป็น neuron เมื่อเลี้ยงใน hydrogel และมีแนวโน้มที่จะพัฒนาไปเป็น astrocyte เมื่อเลี้ยงใน hydrogel ที่มีส่วนผสมของ HA และ สมองหมูบด การเลี้ยงเซลล์ที่ได้จาก apex of pulp (APC) และ periodontal ligament (PDL) ของคน พบว่าทั้ง APC และ PDL มีการแสดงออกของยีนแค่ 2 ตัว คือ SOX9 และ OCN ซึ่ง marker ทั้ง 2 ตัวนี้มีแนวโน้มที่จะเปลี่ยนแปลงไปเป็นอื่นที่ไม่ใช่เซลล์ ประสาทชนิด astrocyte และจากผลการทดลอง การดูการกระตุ้น PI3K โดยผ่านทาง AKT pathway พบว่า APC ที่เลี้ยงบนชีววัสดุที่เตรียมขึ้นมีการกระตุ้น PI3K ลดลง เมื่อเปรียบเทียบกับ control ที่เลี้ยง บน plate ธรรมดา ยกเว้น APC ที่เลี้ยงบน gelatin + HA + brain ที่มีการกระตุ้น PI3K เพิ่มขึ้นและ ให้ผลเช่นเดียวกับเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน NIH/3T3

คำสำคัญ